基于大鼠模型的赤霉素毒理學評價?

圖爾遜娜依·艾力，雒怡倩，吳軍強，王瀟，岳海濤

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830017)

0 引言

紅棗、葡萄等因口感獨特、營養價值高深受人們喜愛．有研究顯示2012―2021年新疆葡萄種植面積及產量位居我國首位[1]．新疆葡萄干產量占全國總產量的95%以上[2]．此外，新疆也是我國紅棗的主要種植地，紅棗產量占據了我國紅棗總產量的半壁江山．GA是新疆紅棗、葡萄種植中常用的生長調節劑，別名920，分子式為C19H22O[3]6．其生物學活性豐富，且在植物生長發育過程中具有誘導無子果實形成、提高坐果率、改善果實品質、防止落花落果、促進果實早熟等關鍵作用[4]．GA在紅棗、葡萄中使用劑量為50～100 mg/L，在開花期連續噴灑，GA處理后幼果期果實內源GA含量顯著上升，果實緩慢生長期棗果內源GA含量快速下降．GA完熟期處理組與對照組相比果實中內源GA含量提高了0.011～0.031 mg/kg．內源GA含量與駿棗表皮厚度在脆熟期和完熟期呈顯著負相關，但相較亞洲國家規定的外源GA在水果及堅果中的使用標準（最大值0.2 mg/kg）存在殘留風險[5]．

現有研究大部分針對GA膨大功能評價，目前國內對GA急性毒性進行了大量的研究，但多部分僅對個別臟器的損傷進行了宏觀評價，對其亞急性毒性研究較少，對重復暴露可能損傷的靶器官不明確且對其毒性效應存在爭議．商桑等[6]研究證明GA沒有毒性，GA在100 mg/kg劑量范圍內重復28天染毒，不會對SD大鼠青春期發育產生顯著影響．根據化學物質毒性數據庫（https://www.drugfuture.com/）的查詢結果，GA對大鼠的LD50>6 300 mg/kg，對小鼠的LD50>8 500 mg/kg，對兔子的LD50>2 g/kg．參照中華人民共和國農業農村部公告第2569號附件14《農藥產品毒性分級標準》[7]，LD50>5 000 mg/kg劑量樣品屬微毒級．也有研究表明GA亞急性毒性，對大鼠連續50天經口給GA后，發現大鼠的肝臟、大腦、脾臟、肺部、腎臟和心臟中丙二醛的濃度明顯上升，脾臟和腎臟中超氧化物歧化酶的活力明顯降低，而大鼠心臟中藥物代謝酶谷胱甘肽-S-轉化酶活力明顯降低[8]．Yasin等[9]評估了GA對大鼠的抗氧化防御系統等存在毒性作用．GA可能會對雌性大鼠和它們的幼仔產生肝毒性，大鼠連續攝入200 mg/kg劑量的GA對其肝臟產生損傷[10]．

由于GA具有提高產量的作用，且在我國法律和國家行業標準中對GA應用的劑量、期限等并沒有具體的指標要求，故GA在農產品和林業產品市場上一直存在著濫用問題．過量或不合理噴灑導致GA在作物中殘留，長期食用可能蓄積人體，從而危害健康．因此，對GA進行毒理學評價是非常有必要的．本文通過觀察SD大鼠經單次和連續28天按噴灑量的倍數暴露于GA后的毒性反應，初步確定其主要毒性靶器官及毒性反應性質、程度，旨在為GA毒性的準確評價及其安全合理用藥、保護環境、生物多樣性和人類健康提供科學依據．

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑（表1）

表1 主要儀器與試劑

1.2 實驗動物

根據《農藥登記毒理學試驗方法第3部分：急性經口毒性試驗序貫法》（GB/T 15670.3―2017）指定的實驗動物，使用SD大鼠進行動物實驗．SPF級SD大鼠購自新疆醫科大學動物研究所，體質量180～220 g，動物生產許可證號：SYXK（新）2021-0004．實驗前動物在實驗環境中適應3～5 d．

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗

將84只SPF級SD大鼠按體重隨機分成6組，每組14只，雌雄各占一半．采用單次灌胃方式染毒，對照組和實驗組GA（500、1 000、2 000、4 000、6 500 mg/kg），連續觀察14 d，記錄大鼠中毒表現，對體重、炎癥因子、組織病理學等指標進行監測、評價毒性效應．

1.3.2 亞急性毒性實驗

將48只SPF級SD大鼠按體重隨機分成4組，每組12只，雌雄各占一半．采用混合飼料染毒方式，對照組和實驗組GA（100、200、400 mg/kg）連續染毒28 d，觀察14 d，記錄大鼠中毒表現，對體重、炎癥因子、組織病理學等指標進行監測、評價毒性效應．

1.3.3 炎癥因子濃度測定

1）標準品的稀釋：在各小試管中加入標準品稀釋液110 μL，然后取原濃度標準品110 μL加入試管中，充分混勻；依次加入至第5個試管，從該試管中抽取110 μL，棄掉．第6只試管作為0號標準品．

2）加入待測樣品：在酶標包被板上加入不同濃度的標準品50 μL；樣本孔中先加樣品40 μL，再加生物素標記的抗體10 μL．

3）加酶及溫育：除空白孔外，每孔加入酶標試劑50 μL，用封板膜封板后置于37 ℃培養箱中溫育30 min．

4）洗滌：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍，小心揭掉封板膜，棄去孔內液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干．

5）顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min．

6）終止及測定：每孔加終止液50 μL，終止反應；以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度OD值．測定應在加終止液后15 min以內進行．

1.3.4 組織病理學觀察臟器組織→10%甲醛固定→乙醇逐級脫水（50%、60%、70%、80%、90%、95%）→二甲苯透明→石蠟浸透和包埋→切片（4 μm）→HE染色→觀察記錄．

1.3.5 GA風險評估

參照中華人民共和國農業農村部公告第1825號《農藥每日允許攝入量制定指南》，采用確定性評估模型對GA風險進行評估，農藥短期攝入量計算公式為：

式中：ESTI為農藥的估計短期攝入量，HR為殘留實驗中農藥的最高殘留量，P為水果日均攝入量，BW為體重．

式中：ARfD為急性參考劑量，UF為急性毒性不確定系數（取100），NOAEL為動物實驗中最大未觀察到有害作用的劑量（NOAEL是在分析評價相關毒理資料的基礎上，找到最敏感動物的最敏感終點）．

式中：%ARfD為急性膳食攝入風險值；%ARfD≤100%代表風險考驗接受，%ARfD>100%意味著存在不可接受急性風險．

ADI參考《農藥每日允許攝入量定制指南（2012年）》[11]進行計算：

式中：NOAEL（mg/kg）為動物實驗中最大未觀察到有害作用的劑量；UF為不確定系數，根據《指南》要求，不確定系數一般為100，同時結合毒理學實驗數據，從4周毒性實驗外推至慢性毒性實驗需放大10倍，推導得到的安全因子（基于動物實驗外推人群時存在的不確定因素而估算的系數）為1 000．

式中：%ADI為慢性膳食攝入風險；%ADI≤100%代表風險考驗可接受，%ADI>100%意味著存在不可接受急性風險．STMR為規范實驗殘留中值．

式中：HI為累積風險；HI≤100%代表風險考驗接受，HI>100%意味著存在不可接受急性風險．

2 結果與分析

2.1 GA急性毒性評價

2.1.1 GA對SD大鼠一般情況影響

最大非致死劑量及毒性分級預測．表2列出了SD大鼠單次灌胃給予6 500、4 000、2 000、1 000、500 mg/kg GA后的存活率，劑量在4 000 mg/kg以上時，可見明顯單次毒性反應，主要的臨床癥狀為自主活動減少、呼吸困難、腹式呼吸、翻正反射消失、陣攣性抽搐．SD大鼠灌胃給予GA后實驗中高劑量組只有1只大鼠出現死亡情況，即最小致死劑量（LD01）為6 500 mg/kg，本次實驗并未觀察到絕對致死劑量（LD100）和半數致死劑量（LD50），在4 000 mg/kg以下劑量未見明顯中毒表現，觀察期內無SD大鼠死亡，故本次實驗最小觀察到有害作用劑量（LOAEL）以及最大非致死劑量（LD0）為4 000 mg/kg，未觀察到有害作用劑量（NOAEL）為2 000 mg/kg．本次實驗雖然未觀察到LD50，但是根據結果可知LD50>6 500 mg/kg，根據食品安全毒性分級，GA屬于無毒級LD50>5 000 mg/kg．死亡率-劑量曲線和概率單位-劑量曲線見圖1．

表2 大鼠單次灌胃給予GA后的存活率

2.1.2 GA對SD大鼠體重的影響

灌胃給予GA后，各組受試SD大鼠的體重與灌胃前相比無顯著差異（P>0.05）．體重統計見圖2．

圖2 大鼠灌胃給予GA后的體重情況

2.1.3 GA對SD大鼠血清中炎癥因子的影響

為檢測單次給藥對大鼠免疫系統是否有影響，檢測血清中IL-6和TNF-α的濃度（圖3）．IL-6各劑量組與對照組無顯著差異（P>0.05），TNF-α各劑量組與對照組也無顯著差異（P>0.05）．

圖3 GA單次給藥對大鼠IL-6和TNF-α的影響

2.1.4 GA對SD大鼠臟器組織病理學影響

通過組織病理學進一步分析GA暴露后對大鼠主要臟器（包括肝臟、腎臟、睪丸和卵巢）的影響．圖4（a）為GA大鼠單次灌胃給藥后肝臟切片，與對照組相比各劑量組未見明顯病變，組織結構正常；圖4（b）為大鼠腎臟切片，與對照組相比未見明顯病變，腎細胞排列整齊，未見大量空泡現象；圖4（c）為大鼠睪丸切片，與對照組相比炎性細胞浸潤情況較多；圖4（d）為大鼠卵巢切片，與對照組相比無明顯病變．

圖4 GA單次暴露組織病理學影響

2.2 GA亞急性毒性評價

2.2.1 GA對SD大鼠體重的影響

給予GA后，GA組雌性大鼠的體重與灌胃前相比沒有顯著差異，雄性大鼠的體重有上升趨勢，但無顯著差異（P>0.05）．體重統計見圖5．

圖5 大鼠給予GA后的體重情況

2.2.2 GA對大鼠炎癥因子的影響

通過組織病理切片觀察到部分臟器存在損傷，為在小分子水平驗證其結果，對GA暴露的SD大鼠血清及部分組織進行了炎癥因子（IL-6和TNF-α）含量檢測．血清中炎癥因子含量見圖6，GA暴露雌雄性大鼠血清中炎癥因子較對照組急劇增加，且呈劑量正相關性，隨著劑量上升雌雄鼠血清中IL-6的含量增加（P<0.01）．雌性大鼠TNF-α有上升趨勢但無顯著差異（P>0.5，圖6(c)），雄性大鼠在中、高劑量與對照組相比有顯著差異（P<0.5，圖6(d)）．

本次實驗對主要臟器（肝臟、腎臟、卵巢、睪丸）組織中炎癥因子含量進行了檢測，結果見圖7．在SD大鼠肝臟組織中，與對照組相比IL-6的含量沒有顯著差異（P>0.5），TNF-α的含量在400 mg/kg劑量組有顯著上升，為對照組的2.9倍．在腎臟組織中，炎癥因子含量在200、400 mg/kg劑量較對照組均顯著上升（P<0.5），IL-6含量為對照組的1.7倍，TNF-α含量為對照組的2.4倍．在卵巢組織中，IL-6含量較對照組在100 mg/kg劑量組呈1倍差異（P<0.5），在200、400 mg/kg劑量組呈極顯著上升（P<0.01），均為對照組的1.3倍．TNF-α含量在400 mg/kg劑量組呈顯著差異（P<0.5），為對照組的1.5倍．在睪丸組織中，200、400 mg/kg劑量IL-6含量呈顯著上升（P<0.5），TNF-α含量極顯著上升（P<0.01），分別為對照組的1.4倍和1.6倍．

2.2.3 GA對SD大鼠臟器組織病理學影響

通過組織病理學進一步分析GA重復暴露后對大鼠主要臟器（包括肝臟、腎臟、睪丸和卵巢）的影響．圖8（a）為大鼠重復暴露于GA后肝臟組織病理變化．100～200 mg/kg劑量大鼠的肝臟組織與對照組相比無明顯病理變化，肝臟組織結構正常；400 mg/kg劑量肝細胞間隙擴大，包內結構松散．圖8（b）為大鼠重復暴露于GA后腎臟組織病理變化．對照組與處理組腎臟細胞排列整齊，未見大量空泡，但中、高劑量組與對照組相比腎臟細胞間隙出現輕微擴大．

圖8（c）為大鼠重復暴露于GA后卵巢組織病理變化．與對照組相比低、中劑量組未見明顯病變，高劑量組與對照組相比炎癥細胞浸潤較多．圖8（d）為大鼠重復暴露于GA后睪丸組織病理變化．對照組與低劑量組睪丸曲細精管生精細胞豐富、排列整齊、層次清楚，可見成熟精子生成、結構正常；中劑量組曲細精管內生精上皮層次減少、稀疏，腔內僅見少量成熟精子生成；高劑量組大量生精細胞壞死溶解，生精上皮層稀疏，且曲細精管內未見精子生成．

2.3 GA風險評估

《中國居民膳食指南（2022）》[12]推薦的水果消耗量為200～350 g/d．國外大多數具有推薦攝入量的國家建議每天攝入超過300 g新鮮水果，按照中華人民共和國國務院新聞辦公室發布的《中國居民營養與慢性病狀況報告（2020年）》[13]，成人男性平均體重為69.9 kg、女性為59 kg，成人平均體重以63 kg計，按風險最大化原則將紅棗和葡萄的每日水果消耗量以0.30 kg/d計．本課題組前期在田間實驗中得到GA在紅棗中的殘留值為0.007 2～0.130 1 mg/kg．本次風險評估中GA在紅棗中殘留量參考文獻[14]．急性毒性實驗中觀察到GA的NOAEL劑量為2 000 mg/kg；亞急性毒性實驗中觀察到的NOAEL為100 mg/kg．GA急性和慢性膳食風險評估結果見表3．

3 討論

GA是一種高效的植物生長調節劑，在中國新疆紅棗、葡萄中廣泛應用，但其對人群可能帶來的風險存在較大爭議，為了探究GA對人體帶來的危害，本文通過急性及亞急性毒性實驗，建立了動物體內毒性模型，根據GA毒性效應，初步探究了GA可能損傷的靶器官，為GA毒性準確評價及其安全合理用藥、制定GA殘留相關標準提供依據．

急性毒性是食品安全性毒理學評價程序的第一階段，通過經口一次性給予或24 h內多次給予受試物后，觀測SD大鼠在短時間內產生的毒性反應[15]．目前國內研究人員多針對GA急性毒性開展宏觀研究，如通過最大耐受法研究GA急性毒性，發現其毒性比較低，毒性分級屬于無毒級[6]，但對可能損傷的靶器官不明確，缺乏對主要臟器的組織病理學觀察．本文通過SD大鼠單次灌胃給予GA，對體內急性毒性進行評價，并觀察到GA暴露后睪丸組織損傷．實驗中未觀察到致死劑量（LD100）和半數致死劑量（LD50），在SD大鼠急性毒性實驗中，GA最高劑量為6 500 mg/kg，初步推測GA對SD大鼠的LD50>6 500 mg/kg，這與化學物質毒性數據庫查詢到的大鼠毒性分級以及商桑等[6]的研究結果一致，均屬于無毒級．為了進一步研究GA對人群生長發育的影響[16]，研究人員發現GA可使仔鼠的生長發育提前，雌性陰道開口時間及雄性小鼠的陰囊下降時間提前[17]．本文急性毒性實驗中，觀察到6 500 mg/kg劑量組SD大鼠睪丸組織病理切片與對照組相比炎性細胞浸潤情況較多，因此，GA高劑量急性暴露可能會對生殖系統產生一定影響．

如上所述，本文通過急性毒性實驗初步觀察了GA高劑量單次暴露后SD大鼠組織病理學切片，結果顯示睪丸組織存在損傷，為進一步研究GA低劑量重復暴露后是否同樣會對靶器官產生損傷，進行了亞急性毒性實驗．目前，國內外亞急性毒性研究表明，0～100 mg/kg劑量范圍內GA對SD大鼠青春期沒有影響[17]；本文低劑量組在重復28天暴露GA后同樣未觀察到對SD大鼠青春期以及生長明顯的影響，但在暴露劑量超過400 mg/kg時，SD大鼠卵巢炎癥細胞浸潤較多．200 mg/kg劑量組曲細精管內生精上皮層次減少、稀疏，腔內僅見少量成熟精子生成；400 mg/kg劑量組大量生精細胞壞死溶解，生精上皮層稀疏，且曲細精管內未見精子生成．

肝臟具有多種功能且代謝旺盛，對外源污染物反應靈敏，因此在毒理學評價中經常作為毒性效應觀察靶器官和細胞毒性觀測模型．有研究通過亞急性毒性實驗證明農藥對大鼠的肝毒性[18]．GA重復暴露會引起肝臟毒性，GA肝臟切片檢查顯示充血、門靜脈和中央靜脈擴張以及血細胞積聚、炎癥細胞浸潤，除此之外損傷跡象還有肝細胞結構松動、肝細胞出現空泡化等[19]．本文中100～200 mg/kg劑量重復暴露后大鼠的肝臟組織與對照組相比無明顯病理變化，肝臟組織結構正常，400 mg/kg劑量組肝細胞間隙擴大，包內結構松散，表現出明顯的損傷．亞急性毒性實驗中觀察到GA的持續攝入導致肝臟、脾臟、腎臟的氧化損傷[20]、炎癥和細胞壞死現象[21]．除肝臟損傷外，本文還觀察到了重復暴露于GA后腎臟組織病理變化，在暴露劑量超過200 mg/kg時腎臟細胞間隙出現輕微擴大，與上述研究結果具有一致性．

研究表明GA在果實生長發育過程中呈逐漸降低趨勢[14]，急性毒性最高劑量為GA暴露量的65～130倍，亞急性毒性實驗高劑量為暴露量的4～8倍，本文參考張賢輝等[22]和顧夢影[23]研究計算急性和慢性膳食風險的評估方法，其中未觀察到有害作用劑量（NOAEL）和最小觀察到有害作用劑量（LOAEL）是物質暴露風險評估中重要的數據[24-25]．本次風險暴露評估中GA累積風險商值小于100%，說明在急性暴露中130倍以內噴灑量的GA膳食中累積風險可被接受，GA在8倍以內重復28天暴露的膳食風險可被接受，但并不代表所有群體均可接受長期蓄積性風險．本次風險暴露評估中參考攝入群體為成年人，未考慮接受度較差的幼兒以及老弱群體，膳食風險商值考慮的是單向農藥（添加劑）殘留的影響，未估計混合疊加與其它藥物使用的情況，所以引起的安全風險有待進一步研究．

綜上所述，如何避免紅棗、葡萄中農藥殘留帶來的風險是一個復雜的問題，需要多方面的努力和配合．首先，最根本是從源頭把好紅棗、葡萄質量關，種植者要提高對農藥危害的認識并在采摘前科學、合理、規范地使用農藥．其次，有關部門作好紅棗、葡萄質量的監管和監測，加強知識宣傳及禁限用農藥銷售渠道的管理，完善相關法規和標準，研發高效且無毒的GA替代品；加工過程中嚴格把關紅棗、葡萄的清洗、晾曬方式．最后，消費者在食用前對其進行徹底清洗、浸泡等可以有效減少殘留的攝入．

4 結論

依據本實驗結果，GA急性毒性屬于低毒，單次高劑量暴露時損傷的靶器官是睪丸；GA重復暴露后主要毒性反應集中在肝臟、腎臟、卵巢、睪丸中，最大未觀察到有害作用劑量為100 mg/kg．紅棗、葡萄中GA急性和慢性風險商值均低于100%，說明紅棗、葡萄中GA殘留膳食攝入風險很低，造成的累積風險可以接受．