不同加工類型樣品大腸菌群檢測方法選擇研究

鄭二帥，曹 猛，李 孌，梁蘭蘭，廖熙娜

（廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東中山 528400）

0 引言

大腸菌群作為食品安全控制環節中重要指標之一，GB 4789.3—2016 中提供了2 種方法，分別為第一法（MPN 法） 與第二法（平板計數法）[1]，不同的企業會根據自身的試驗室設備、試劑、人員技能、樣品種類及對檢測結果交期的需求。自主選擇第一法（MPN 法） 或第二法（平板計數法） 進行檢測，對于2 種方法檢測靈敏性，不同類型樣品最適的檢測方法，以確保結果的符合性研究的較少。規范不同類產品最適宜的檢測方法，把好質量關，確保生產產品的食品安全性，是作為食品生產品控工作者的核心職責。

通過對不同類型樣品同時用2 種檢測方法進行檢測，對比檢測結果差異性，對差異性原因進行調查研究，為不同樣品選擇檢測方法提供指導依據[2]。

大腸菌群測定第一法（MPN 法），采用以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） 為主要試劑的檢測方法，通過在（36±1） ℃培養24～48 h，對產氣發酵管，轉接到煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 管中，（36±1） ℃培養條件下進行驗證試驗，確定樣品中大腸菌群最大可能數MPN 值。

GB/T 4789.3—2016 大腸菌群測定第二法（平板計數法），采用結晶紫中性膽鹽瓊脂（VRBA） 主要試劑，以通過在（36±1） ℃培養24～48 h，挑取典型和可疑菌落至煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 管中，（36±1） ℃培養條件下培養24～48 h 進行復發酵驗證試驗。

1 材料試劑與試驗方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

抽取兩類典型樣品，A：某公司經生產加工產品，細胞遭受破損的樣品，分別為醬料半成品樣200 份和腐乳半成品樣220 份；B：某公司員工手部、工作服擦拭抽樣，菌落細胞未經物理化學破壞的樣品，共150 份。

1.1.2 試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、無菌磷酸鹽緩沖液（KHPO）、無菌生理鹽水、1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液。

1.2 試驗方法

依據標準：GB 4789.3—2016 的方法要求，分別采用第一法（MPN 法） 和第二法（平板計數法） 對樣品進行檢測，依據產品內控標準，對照檢測結果對產品進行合格率判定。

1.3 樣品合格率判定標準

樣本的大腸菌群數合格判定標準依據企業標準制定，大腸菌群數＜3.6 MPN/g 或者＜3.6 CFU/g。

2 檢測過程及結果

2.1 檢測過程

樣品檢測均使用同一品牌同一批次的試劑，消除試劑的誤差影響，檢測人員為同一組2 名人員，均為檢測經驗3 年以上人員，以消除檢測過程的人員操作誤差。

2.2 檢測結果

第一法（MPN 法） 和第二法（平板計數法） 的檢測結果比較見表1，不同檢測方法樣品不合格率對比見圖1。

圖1 不同檢測方法樣品不合格率對比

表1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板計數法） 的檢測結果比較

2.2.1 結果分析

由表1 可知，采用GB 4789.3—2016 檢測腐乳、醬料半成品樣、員工手部、工作服擦拭樣的不合格率經統計學分析（X2=0.076，p＞0.05） 差異無顯著性，在總計570 份樣品，第一法（MPN 法） 檢測結果超出內控標準樣品數為44 個，占比7.72%。第二法（平板計數法） 檢測結果超出內控標準樣品數為33 個，占比5.79%。第二法（平板計數法） 與第一法（MPN 法） 相比，絕對偏低1.93%，同比相對偏低25.0%。

不同類樣品檢測結果差異性較大，其中腐乳、醬料半成品樣品，第一法（MPN 法） 的檢測結果依據內控標準判定不合格率，分別為8.18%，5.50%；第二法（平板計數法） 檢測結果依據內控標準判定不合格率分別為5.45%，3.50%。第二法（平板計數法） 與第一法（MPN 法） 相比，分別絕對偏低2.75%，2.00%，同比相對偏低33.6%，36.4%；2 種方法的檢測結果偏差比較大，第二法（平板計數法） 檢測量明顯低于第一法（MPN 法） 的檢出量。

員工手部、工作服抽樣品，第一法的檢測結果依據內控標準判定不合格率為10.0%，第二法（平板計數法） 的檢測結果依據內控標準判定不合格率為9.3%，第二法（平板計數法） 與第一法（MPN 法）相比，絕對偏低0.7%，同比相對偏低7%；2 種方法的檢測結果偏差不明顯。

2.2.2 原因分析

（1） 樣品的差異性- 細胞破損程度。腐乳、調味醬樣品中存在的鹽分、香辛料、防腐劑等抑菌物質會使微生物生長受到抑制，導致微生物代謝緩慢、代謝速率不一致。同時，調味醬樣品中存在的油脂會包埋微生物，影響生長。該類產品經歷了物理打磨、加熱等生產加工破壞，部分細胞處于受損狀態，活性不足。需要在修復受損細胞后方能進入對數生長期進行繁殖生長。

設備、容器工器具表面、手部表面取樣，通過涂抹、擦拭或沖洗取得的樣品中，含量微生物大多處于完好活躍狀態，在適宜條件下能夠快速進入對數生長期進行繁殖，在檢測過程中顯化出來。

（2） 檢測方法差異性。第一法（MPN 法） 中，初發酵試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白豚肉湯（LST） 中含有磷酸氫二甲和磷酸二氫鉀是較好的緩沖劑，能夠較好維持LST 肉湯的PH 處于相對穩定狀態，更適合大腸菌群生長[3]。第一法（MPN 法） 的初發酵時間是24～48 h，相對延長的初發酵時間，可使受損的細胞得到較為充分的恢復時間。因為加工食品大多經過磨碎、高溫或冷凍等處理，大部分細菌的細胞處于受損狀態，細胞修復恢復活性需要時間較長，延長到48 h，可以使細胞得到較為充分的恢復時間，進入對數生長期后積累一定的量，使檢測結果顯化出來，從而使初發酵管呈陽性，降低漏檢幾率。

第二法（平板計數法） 中，在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂的培養時間為18～24 h，此過程中，部分受損的細胞尚未修復完畢進入對數生長期[4]。沒有充足的時間在平板上形成菌落形態，檢測操作時覆蓋的瓊脂厚薄程度存在差異，也會造成菌落呈現的不一致性，存在一定數量的漏檢菌落群，因此結果偏低[5]。

3 結論

3.1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板計數法） 檢測靈敏性

（1） 對于經過破壞性生產加工的樣品，使用第一法（MPN 法） 檢測的檢出量要平均高于第二法（平板計數法） 的檢出量。第一法（MPN 法） 的檢測靈敏性更高一些。

（2） 對于一般性表面擦拭抽取樣品，如設備、容器工器具表面、手部表面取樣等，第一法（MPN法） 和第二法（平板計數法） 的檢測量水平基本一致，無明顯差異性。2 種方法檢測靈敏性無明顯差異性。

3.2 檢測方法優劣對比性

在方法優劣性對比，第一法（MPN 法），優點：檢測靈敏度高，準確性更強，檢測操作過程相對比較簡便，對人員操作技能要求相對較低；缺點：耗時長，需要72～96 h。第二法（平板計數法）[6]，優點：耗時短，需要48～72 h；缺點：相對第一法的靈敏度要略低，檢測操作步驟多，操作比較繁瑣，對平板典型菌落的判定和計數需要較高的認知能力，對檢測人員技能要求高，檢測成本高。

3.3 檢測指導建議

在方法選擇上，可以按照如下原則選擇：

（1） 對于生產過程半成品及終產品等經歷破壞性加工的樣品，可優先選擇第一法（MPN 法） 進行檢測，以確保檢測結果接近的真實水平的符合度。

（2） 對于一般性表面擦拭抽取樣品，如設備、容器工器具表面、手部表面取樣等，第一法（MPN法） 和第二法的檢測量水平基本一致，無明顯差異性。試驗室可根據自身的試劑、儀器及交期要求自由選擇檢測方法。

（3） 對于部分樣本目標菌含量較高，需要盡快了解樣本目標菌群大致含量的，可采用第二法（平板計數法） 進行檢測，通過平板上的典型菌落，做出大致性的初步結果報告，然后復發酵進一步長期驗證試驗。

建立在選取的2 種典型樣本類型基礎上做的分析結論，作為指導性的建議，并無絕對的要求，各實驗室需要綜合根據試驗條件、檢驗交期、成本控制、人員技能等方面進行綜合判斷，選擇檢測方法。