液相色譜- 串聯(lián)質譜法檢測信陽水牛乳中唾液酸含量

張彩芳，徐 佳，張瑞廷，2

（1.漯河食品職業(yè)學院，河南漯河 462333；2.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河 462300）

中國是世界第三大水牛養(yǎng)殖大國，信陽水牛作為中國水牛地方優(yōu)良品種之一，主產(chǎn)于河南省信陽市，中心產(chǎn)區(qū)為信陽市的光山、羅山、新縣等縣區(qū)[1]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)機械的發(fā)展，信陽水牛逐步從單純的役用向乳用、肉用方向轉化[2]。信陽水牛產(chǎn)乳性能較好，且乳脂率高達5%～10%，泌乳期一般7～8 個月，也有長達10 個月以上的，平均日產(chǎn)乳量3～5 kg。

水牛乳作為世界第二大乳源，具有良好的食用安全性[3]，其蛋白質、脂肪、維生素等含量遠高于奶牛乳，免疫球蛋白G、溶菌酶等生物活性物質含量達到奶牛乳的5～10 倍[4]。同時，水牛乳中的維C、維E 等含量均高于奶牛乳。陳瑞芳[5]研究結果表明，水牛初乳中的免疫球蛋白G（lgG）、免疫球蛋白A（lgA）、類胰島素生長因子（IGF-1） 含量分別是常乳的41.83，12.44，3.07 倍，說明水牛乳含有生物活性成分。Saksena R 等人[6]從水牛乳低聚糖中分離得到一種新型戊糖，具有免疫刺激活性，可提高免疫應答反應。羅曾玲等人[7]均對水牛乳中過敏原進行了相關研究，用益生菌水牛酸奶飼喂大鼠，發(fā)現(xiàn)益生菌水牛酸奶具有清除自由基的作用[8-9]。李玲等人[10]研究表明，水牛乳多肽具有抗氧化作用。Clare D A 等人[11]的研究顯示，水牛乳中具有抗血栓肽作用的κ- 酪蛋白。潘健存[12]研究結果顯示水牛初乳不僅能增強機體的免疫力，且有降糖降脂作用。水牛乳中的中鏈脂肪酸含量較飲用牛乳高，飲用水牛乳能使老年人的膽固醇水平降低，可預防老年性疾病[13-14]。Colarow L 等人[15]研究結果均表明，水牛乳具有抗炎、抗菌活性作用。以上研究結果均表明水牛乳具有一定的增強免疫力、抗氧化等功能特性，作為高級營養(yǎng)食品之一，水牛乳正逐漸成為人們消費的“新寵”[16-18]，前述研究均集中在水牛乳的營養(yǎng)和功能特性方面，少見對水牛乳中唾液酸的相關研究。

唾液酸（Sialic acid，SA） 是一種天然的碳水化合物，從唾液腺黏蛋白中提取分離得到[19]，故以唾液酸命名。唾液酸是高等動物和某些微生物具有的重要分子，在自然界分布很廣，可作為重要物質基礎實現(xiàn)糖復合物結構及功能多樣化[20]，保護了生物大分子和細胞免受酶和免疫的攻擊。2017 年，國家衛(wèi)健委7 號文將N- 乙酰神經(jīng)氨酸批準為新食品原料。目前，唾液酸生物學功能以及其應用于疾病預防與治療方面的研究日益受到重視。動物試驗結果顯示，在仔豬膳食中添加唾液酸，可使大腦額葉皮質中唾液酸的含量增加，提高與學習相關的2 個基因的表達[21]。同時也有研究表明，SA 作為腦部營養(yǎng)素的一種，能促進嬰幼兒大腦發(fā)育、增強學習能力、發(fā)育能力[22]。

測定SA 含量的方法種類眾多，目前主要有分光光度法、色譜法（高效液相色譜法及氣相色譜法）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、核磁法及液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS） 等方法?；赟A 的化學性質，其容易與樣品基質結合，導致前處理過程中純化難度增加，由于SA 含量差異較大，要求檢測方法的線性范圍寬，抗干擾能力強。分光光度法存在敏感度不高、定量不夠準確等問題。酶聯(lián)免疫法成本較高且操作復雜。因液相色譜- 串聯(lián)質譜法無需衍生即可對SA 定性定量測定且靈敏度高，采用超高效液相色譜- 串聯(lián)質譜法定性定量測定水牛乳中的SA 含量，為進一步研究水牛乳中的SA 提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 6470 型液相色譜- 三重四極桿質譜儀；ML204T 型電子分析天平，梅特勒- 托利多儀器，上海有限公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器，廣東晉元科技有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q 型超純水儀，美國Millipore 公司產(chǎn)品；氮吹儀，美國Organomation 公司產(chǎn)品；旋轉蒸發(fā)儀，德國Heidolph 公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

水牛乳，采自信陽水牛保種場；甲醇（色譜純），乙酸銨（色譜純），F(xiàn)isher 公司提供；唾液酸標準品（純度大于99%），Sigma 公司提供；HLB 固相萃取柱，Waters 公司提供；三氯乙酸（分析純）、鹽酸（優(yōu)級純），天津市科密歐化學試劑有限公司提供。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters AtiantisTMT3（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：甲醇+0.1%乙酸銨溶液（4+6）；流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，柱溫35 ℃。

1.3.2 質譜條件

電離模式：電噴霧負離子（ESI-） 模式；離子源溫度150 ℃，毛細管電壓2.8 kV，干燥氣溫度450 ℃，干燥氣流量650 L/h，錐孔反吹氣流量150 L/h，檢測模式為多反應監(jiān)測（Multi-reaction monitoring，MRM）模式。

唾液酸的多反應監(jiān)測（MRM） 條件見表1。

表1 唾液酸的多反應監(jiān)測（MRM） 條件

1.3.3 標準溶液的制備

精確稱取唾液酸標準品，加入甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成唾液酸質量濃度為1 000 g/L 的標準品儲備液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

標準品溶液系列：用流動相將1 000 g/L 標準品儲備液分級稀釋至10 μg/L，再分別稀釋成質量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL的標準溶液系列。

1.4 樣品前處理

稱取水牛乳樣品（5.00±0.01） g 于50 mL 離心管中，加入質量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液20 mL，渦旋振蕩混勻樣品，超聲10 min，加入質量分數(shù)為0.1%的鹽酸溶液5 mL，超聲5 min 后轉移至50 mL容量瓶中，用超純水多次清洗離心管，清洗液轉移至容量瓶并用超純水定容，于80 ℃水浴水解2 h，冰浴至室溫，以轉速12 000 r/min 離心15 min，取1 mL 上清液于真空旋轉蒸發(fā)至近干，用流動相定容至1 mL 振蕩超聲，0.22 μm 有機濾膜過濾，待測。

2 結果與分析

2.1 質譜結果

分別嘗試了正負離子模式，對唾液酸母離子進行全掃描后，發(fā)現(xiàn)正離子模式相比較與負離子模式，不僅母離子豐度偏低，產(chǎn)生的離子碎片更為復雜，且背景干擾更大，故最終選擇負離子模式。按照儀器條件對水牛乳中唾液酸含量進行測定。

MRM模式下的提取離子流圖見圖1。

圖1 MRM 模式下的提取離子流圖

2.2 定量限和檢測限試驗結果

以信噪比S/N≥3 計算方法的檢出限為0.3 μg/kg，以信噪比S/N≥10 計算方法的定量限為1.2 μg/kg。該方法靈敏度高，可滿足水牛乳中唾液酸的檢測要求。

2.2.1 回收率試驗結果

在水牛乳基質中分別加唾液酸標準品濃度的50%，100%，150%，重復測量3 個不同濃度加標量3 次，結果表明回收率的RSD 值為2.48%，回收率為91.67%～98.15%，平均回收率為95.29%。

樣品加標回收率見表2。

表2 樣品加標回收率

2.2.2 重復性試驗結果

重復性試驗結果見表3。

表3 重復性試驗結果

分別稱取6 份水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后進樣分析。由表3 可知，6 份水牛乳樣品中唾液酸含量的RSD 值為3.67%，證明該方法重復性良好。

2.3 線性回歸試驗結果

分別取質量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL 的標準溶液，不同質量濃度標準品進樣3 次。以3 次峰面積的平均值為縱坐標，標準品濃度為縱坐標繪制標準同線，計算標準曲線方程，結果表明唾液酸標準品在0.01～2.00 μg/mL 質量濃度范圍內，與峰面積的線性關系良好，相關度為0.999 7。

線性回歸試驗結果見表4。

表4 線性回歸試驗結果

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后，分別測定其在放置2，4，6，8，10 h 后的峰面積，RSD 值為2.30%，表示該樣品溶液在10 h 內穩(wěn)定。

穩(wěn)定性試驗結果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗結果

2.5 樣品測定

分別選取5 種不同存欄期的水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后測定其唾液酸含量。

不同存欄期水牛乳中唾液酸含量見表6。

表6 不同存欄期水牛乳中唾液酸含量

3 結論

唾液酸作為重要的元素參與嬰幼兒大腦發(fā)育和認知發(fā)育。研究采用液相色譜- 串聯(lián)質譜法對信陽水牛乳中唾液酸含量進行初步測定。結果表明，信陽水牛乳中唾液酸的含量為177～220 mg/kg。劉爽等人[23]2021 年對5 種市售牛乳樣品中的唾液酸含量進行測定，結果表明5 種市售牛乳中唾液酸的含量為177.6～228.9 mg/L，該研究結果與之相接近。

該研究建立了液相色譜- 串聯(lián)質譜法測定水牛乳中唾液酸的研究方法，樣品預處理操作簡單，無需衍生，分析范圍較寬（0.01～2.00 μg/mL），相關系數(shù)達0.999 7，線性關系良好。采用該方法，信陽水牛乳樣品的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，檢測方法相對靈敏，精密度和準確性良好。信陽水牛乳中唾液酸回收率結果表明，不同濃度水平的樣品加標回收率均在90%以上，加標回收含量的RSD為2.48%。該方法操作簡單，降低了水牛乳中基質的干擾，可準確地測定信陽水牛乳中唾液酸的含量，為信陽水牛乳中唾液酸的測定提供有效可行手段，為信陽水牛的合理保護、乳及乳制品的開發(fā)利用探索更多可能性。