基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析白龍散治療仔豬腹瀉的機(jī)制

郭 翱,顧進(jìn)華,劉自揚(yáng),王學(xué)偉,蘇富琴

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

仔豬腹瀉是導(dǎo)致仔豬生長受損和仔豬死亡率明顯上升的重要因素,是豬場一直需要解決的難題。仔豬腹瀉一般分為病原性腹瀉和非病原性腹瀉,病原性腹瀉又分為細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲性腹瀉,其中細(xì)菌性腹瀉為主要原因,產(chǎn)腸毒素大腸桿菌最為常見;非病原性腹瀉一般由飼喂不當(dāng)或應(yīng)激反應(yīng)所致[1］。仔豬發(fā)生腹瀉后,部分養(yǎng)殖戶采用抗菌藥進(jìn)行治療,但抗菌藥的不規(guī)范使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥,從而使抗菌藥無效。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021-2025年)》,號召養(yǎng)殖戶根據(jù)養(yǎng)殖管理和防疫實(shí)際,科學(xué)規(guī)范使用抗菌藥,提倡應(yīng)用獸用中藥、微生態(tài)制劑。獸用中藥以多靶點(diǎn)協(xié)同作用、不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。白龍散收載于《中國獸藥典》,由白頭翁、龍膽、黃連3味藥組成,具有清熱燥濕、涼血止痢等功效。毛成榮等[2］、王尚榮等[3］在臨床研究發(fā)現(xiàn),白龍散用于治療仔豬腹瀉的效果顯著,但目前白龍散治療仔豬腹瀉的分子作用機(jī)制尚不明確。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)模型,從整體角度對中藥進(jìn)行研究,已成為一種科學(xué)解釋中藥有效性和科學(xué)性的新策略,在多方面的中藥研究中已具備成功應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)[4］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論,融合多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容,進(jìn)行“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,探索藥物與疾病間相關(guān)性的新學(xué)科[5］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究白龍散治療仔豬腹瀉的可能分子作用機(jī)制,以期為開展進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選白龍散活性成分及靶標(biāo)蛋白 利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(https:∥tcmspw.com/tcmsp.php)檢索白龍散中各味藥所含的化學(xué)成分及其對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白,并將各味藥分別按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18篩選,獲得其活性成分及相對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。

1.2 靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)化為靶基因 將獲得的靶標(biāo)蛋白導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/),物種選擇為“sus scrofa”,利用VLOOKUP函數(shù)將靶標(biāo)蛋白與靶基因?qū)?yīng),獲得規(guī)范的靶基因名稱,所得結(jié)果即為活性成分所作用的靶點(diǎn)。

1.3 獲取腹瀉相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards(http:∥www.genecards.org/)和OMIM(https:∥www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“diarrhea”,將兩數(shù)據(jù)庫獲得的結(jié)果進(jìn)行合并,去除重復(fù)靶點(diǎn),從而得到腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 獲取白龍散作用于仔豬腹瀉的靶點(diǎn) 將白龍散活性成分作用的靶點(diǎn)與腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)粘貼到Venny2.0.2(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html)中,制成韋恩圖,其交集結(jié)果即為白龍散作用于仔豬腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建白龍散與仔豬腹瀉靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將白龍散活性成分和白龍散作用于仔豬腹瀉的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件,構(gòu)建白龍散與仔豬腹瀉靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將白龍散作用于仔豬腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥cn.string-db.org/),選擇Multiple proteins,物種選擇“sus scrofa”,建立PPI網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出TSV文件。將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件,基于degree大小構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 GO和KEGG富集分析 將白龍散作用于仔豬腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、物種選擇為“sus scrofa”,進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。利用微生信工具(http:∥www.bioinformatics.com.cn/)對富集分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到GO富集條形圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白龍散活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,篩選白龍散中符合OB≥30%和DL≥0.18的有效成分35種,其中白頭翁11種、龍膽10種、黃連14種。

2.2 白龍散作用于仔豬腹瀉靶點(diǎn)結(jié)果 通過GeneCard和OMIM數(shù)據(jù)庫收集并刪除重復(fù)靶點(diǎn),獲得腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)6019個,對白龍散作用靶點(diǎn)與腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)取交集,得到92個共有靶點(diǎn),如圖1所示。

圖1 白龍散作用靶點(diǎn)與腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 白龍散作用于仔豬腹瀉靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 白龍散作用于仔豬腹瀉的活性成分見表1,將白龍散作用于仔豬腹瀉的活性成分和對應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建“白龍散活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。該網(wǎng)絡(luò)中共有115個節(jié)點(diǎn)(活性成分23個、靶點(diǎn)92個),213條相互作用的邊,內(nèi)圈代表白龍散活性成分、外圈代表這些活性成分作用的靶點(diǎn)、邊代表兩者的相互作用。由圖2可知,槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、小檗堿(MOL001454)與各靶點(diǎn)連接度較高,提示這些活性成分與治療仔豬腹瀉密切相關(guān)。

表1 白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分

圖2 白龍散活性成分-作用于仔豬腹瀉靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)路 將白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉的92個靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出TSV文件,將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件,按照Degree值從大到小排序,取排序前二十的靶點(diǎn)構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖如圖3。在圖3中,節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)越大,度值越大,說明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。由圖3可知,TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用較大,提示它們可能為白龍散治療仔豬腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 GO功能富集分析 將白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉的92個靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫,設(shè)定P<0.05進(jìn)行GO分析。GO分析分為生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)3個部分,共同描述基因產(chǎn)物的功能[6］。GO功能富集分析得到GO條目233個,其中生物過程(biological process,BP)181個條目,細(xì)胞組分(cellular component,CC)13個條目,分子功能(molecular function,MF)39個條目。根據(jù)P值從小到大排序,選擇前15條GO條目,利用微生信工具繪制GO富集分析見圖4。圖4顯示,生物過程主要涉及對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、免疫球蛋白產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)向調(diào)控、慢性炎癥反應(yīng)對抗原刺激的負(fù)調(diào)節(jié)等;細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外等;分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性、蛋白二聚化活性等。

圖4 GO富集分析圖

2.6 KEGG通路富集分析 將白龍散作用于仔豬腹瀉的92個靶點(diǎn)導(dǎo)入輸入DAVID數(shù)據(jù)庫,設(shè)定P<0.05進(jìn)行KEGG通路分析,得到123個富集通路條目,根據(jù)P值從小到大排序,選擇前15條KEGG條目,利用微生信工具繪制KEGG富集分析,如圖5所示。主要通路有癌癥相關(guān)通路、IL-17信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

中藥成分多而復(fù)雜,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法來預(yù)測中藥活性成分、作用靶點(diǎn),可以為探索中藥治療疾病的作用機(jī)制、新藥研發(fā)和發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)證提供思路[7］。王佳俊等[8］采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索黃連厚樸湯改善潰瘍性結(jié)腸炎的主要活性成分及作用機(jī)制并在動物實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明黃連厚樸湯能通過調(diào)節(jié)ROS表達(dá)、降低細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程發(fā)揮作用。程彬峰等[9］采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法并結(jié)合豚鼠哮喘模型和人支氣管上皮細(xì)胞炎癥模型,揭示了清肺消炎丸抗炎作用的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。李紹強(qiáng)等[10］采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究黃連解毒湯治療銀屑病的活性成分、作用靶點(diǎn)及信號通路,為臨床使用和新藥研發(fā)提供參考。

仔豬因免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)發(fā)育不完善,易受到各種病原微生物的侵襲,再加上各種應(yīng)激因素的影響,容易出現(xiàn)腹瀉等癥狀。隨著對中藥的深入研究,發(fā)現(xiàn)中藥通過多種成分,作用于多靶點(diǎn)、多通路在治療感染性和應(yīng)激性腹瀉均具有獨(dú)特功效。同時,中藥資源豐富,具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢。在獸醫(yī)臨床應(yīng)用中,中藥復(fù)方制劑“白頭翁散”、“黃連解毒湯”、“止痢散”、“白龍散”等用于治療仔豬腹瀉的效果顯著,但治療仔豬腹瀉的作用機(jī)制尚不清晰。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分、作用靶點(diǎn)進(jìn)行探索。通過網(wǎng)路藥理學(xué)初步篩選白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、小檗堿等。槲皮素是一種持久的抗炎物質(zhì),具有很強(qiáng)的抗炎能力[11］。梅華迪等[12］研究表明,在飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可降低仔豬腹瀉發(fā)生率。多項(xiàng)研究表明,β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[13］。Yuhang Jin等[14］研究發(fā)現(xiàn),山奈酚能夠降低豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡。李春林等[15］研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可有效的抑制LPS誘導(dǎo)的豬腸道上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng),其機(jī)制與抑制豬腸道上皮細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá),抑制LPS激活的NF-κB/MAPK信號通路的關(guān)鍵蛋白的磷酸化和表達(dá)等有關(guān)。以上研究表明,白龍散中4種活性成分均具有抗炎活性,可能是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分。

PPI分析結(jié)果顯示,TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等靶點(diǎn)可能與仔豬腹瀉密切相關(guān)。TNF是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,它通過與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、凋亡和誘導(dǎo)炎癥[16］。MAPK14作為MAPK家族中的重要成員之一,其表達(dá)異常可致機(jī)體生理功能紊亂,引發(fā)機(jī)體免疫功能失調(diào),導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生,與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[17］。VEGFA在控制細(xì)胞生存、生長、分化、粘附、遷移、腫瘤血管生成、傷口愈合和組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[18］。VEGFA可以促進(jìn)腸細(xì)胞遷移和腸道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)[19］。IL-6是一種重要的前促炎癥性細(xì)胞因子,可通過與下游受體結(jié)合形成多種復(fù)合物,誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),參與調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答[20］。CASP3在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用,參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的胱天蛋白酶的激活級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[21］。以上分析結(jié)果表明,白龍散的活性成分可能通過作用于TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等靶點(diǎn)來調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和腸道上皮細(xì)胞修復(fù)來發(fā)揮作用。

GO分析結(jié)果顯示,白龍散通過免疫球蛋白產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)向調(diào)控、慢性炎癥反應(yīng)對抗原刺激的負(fù)調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮治療作用。KEGG通路富集結(jié)果顯示,白龍散主要通過調(diào)控IL-17信號通路。IL-17是一個重要的促炎癥細(xì)胞因子,IL-17在多種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,IL-17信號通路調(diào)控異常導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生[22］。因此,白龍散的活性成分可能通過調(diào)控炎癥信號通路、免疫應(yīng)答發(fā)揮治療仔豬腹瀉的作用。

綜上所述,白龍散治療仔豬腹瀉機(jī)制與槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、小檗堿等活性成分作用于TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等關(guān)鍵靶點(diǎn),調(diào)控IL-17等信號通路來調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。同時,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可以較好地闡述白龍散通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來治療仔豬腹瀉。