基于網絡藥理學與分子對接探究苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的作用機制

房思遠,趙子玉,榮 軒,朱永明,張世佳,李育明,4,趙兵令

(1.河北農業大學中獸醫學院,河北保定 071000;2. 河北維爾利動物藥業集團有限公司,石家莊 050200;3. 河北省中獸藥產業技術研究院,石家莊 050200;4. 河北維爾利生物科技有限公司,石家莊 050200)

輸卵管炎在雞(Gallusgallus)中發生普遍,表現為產蛋高峰消失,產蛋量減少,蛋品質下降,導致撲殺及治療成本增加,阻礙了雞規模化養殖的可持續發展[1］。輸卵管炎的誘因為雞舍環境條件差,為大腸桿菌和沙門氏菌等細菌的滋生創造了有利條件,細菌通過泄殖腔到達輸卵管,引起輸卵管機能障礙, 卵泡發育不良, 蛋白分泌功能受損, 對雞的繁殖性能造成極大影響[2］。雞蛋是人類優質蛋白獲取的重要途徑,因此蛋雞輸卵管炎的治療尤為重要。抗生素的濫用不僅會產生獸藥殘留等一系列問題,更重要的是對人類安全及生態環境等都會造成極大的威脅,而中獸藥以其安全性好、毒副作用小、殘留量少等優勢被視為替抗的重要手段之一。

苦虎益母口服液是本實驗室篩選出的治療蛋雞輸卵管炎的中藥組方,由苦參、虎杖、益母草、黃芪、菟絲子幾味藥組成。苦參為君藥,具有燥濕、抑菌、利尿等功效[3］,能夠清除輸卵管道的炎癥,減少炎性滲出物;虎杖為臣藥,具有止痛、散瘀、解毒等功效[4］,能夠清除生殖道內的淤堵,減輕生殖疼痛;黃芪和菟絲子為佐藥具有益氣健脾[5］,滋補肝腎[6］的功效,二者合用在促進炎癥恢復的同時促進卵泡發育;益母草為使藥,具有活血、化瘀、利尿和通路的功效[7］,能夠清除生殖道的炎性水腫,減輕產后瘀痛。五種藥材合用具有清熱解毒、化瘀通絡、健肝益氣、滋補肝腎之功效,用于治療雞輸卵管炎能夠改善卵泡發育不良,提高產蛋率,減輕炎性滲出等。網絡藥理學涵蓋了包括系統生物學等多門學科,能夠揭示藥物、成分、靶點和疾病之間的網絡聯系,能夠分析并預測中獸藥復方的作用機制,這與中醫的整體觀念相一致。因而采用網絡藥理學研究苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的作用機制并采用分子對接進一步驗證,為苦虎益母口服液的下一步研究提供參考依據。

1 數據庫平臺與方法

1.1 苦虎益母口服液有效成分及目標靶蛋白的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http: ∥tcmspw.com/tcmsp.php),對苦虎益母口服液(苦參、虎杖、益母草、黃芪、菟絲子)進行有效成分的篩選,條件為口服生物利用度(OB≥30%) 和類藥性(DL≥0.18),物種為“Gallusgallus”,獲取相應的蛋白質靶標,并利用Uniprot數據庫(https: ∥www.uniprot.org/)對其名稱進行規范化處理。

1.2 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶點基因網絡關系圖構建 利用Cytoscape 3.8.2軟件,繪制1.1得到的苦虎益母口服液藥物-有效活性成分-靶點基因網絡圖。

1.3 雞輸卵管炎靶點的篩選 以“Gallusgallussalpingitis”、“Chickensalpingitis”、“salpingitis”、為關鍵詞,在基因數據庫(GeneCards,https: ∥www.genecards.org/)、在線孟德爾遺傳數據庫(OMIM,https: ∥omim.org)、毒理基因組學數據庫(CTD,http:∥ctdbase.org/)進行檢索,整合并標準化得到的數據,刪除重復項。

1.4 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎交集靶點的獲取 利用微生信平臺(http:∥www.bioinformatics.com.cn/),得到1.1獲得的藥物成分靶點與1.3項獲得的疾病成分靶點的共同靶點,生成Veen圖。

1.5 蛋白質-蛋白質互作(PPI)網絡構建 將從1.4項獲得的苦虎益母口服液成分與雞輸卵管炎交集靶點利用基于公共數據庫和文獻信息的蛋白質相互作用網絡數據庫(STRING,https: ∥www.string-db.org/)進行PPI網絡圖的構建,設定物種為“Gallusgallus”,置信度>0.4,并隱藏游離節點,其他指標均為默認值,下載其“tsv”文件。將下載好的“tsv”文件導入Cytoscape 3.8.2軟件,構建可視化網絡圖,并利用軟件自身工具Network Analyzer計算Degree值,篩選核心靶點。

1.6 GO和KEGG通路富集分析 將1.4項獲得的交集靶點利用DAVID數據庫(https: ∥david.ncifcrf.gov/)進行GO功能和KEGG信號通路富集分析,物種選擇 “Gallusgallus”,篩選偽發現率<0.05的條目,繪制其條形圖和氣泡圖。

1.7 分子對接 為驗證網絡藥理學分析結果,通過PubChem數據庫(https: ∥phbchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找關鍵藥物活性成分,并下載其3D結構,保存為“SDF”,作為配體文件,并利用Open Babel(https:∥openbabel.org)轉換為moL 2格式。從UniProt數據庫中根據關鍵靶點的Entry值,下載關鍵靶點的3D結構,保存為“PDB”格式作為受體文件。將處理好的文件分別導入到AutoDock Tools中進行去除水分子、加氫等處理后再利用AutoDock Tools進行分子對接。利用PyMol2.6進行可視化。

2 結果與分析

2.1 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶點基因網絡關系圖構建 通過TCMSP數據庫檢索,得到苦參有效成分25個,靶點163個;虎杖有效成分10個,靶點86個;黃芪有效成分21個,靶點142個;菟絲子有效成分10個,靶點86個;益母草有效成分8個,靶點70個。合并去重后得到靶點共計77個。將有效成分經Uniport數據庫和規范化的靶點導入Cytoscape 3.8.2,實現數據可視化,如圖1。并根據其Dgree篩選出排名前10的有效活性成分(表1)。并根據圖1靶點的連接Dgree值,獲取前10的有效成分作用靶點信息(表2)。

藍綠色代表有效成分靶點;紅色代表藥物交集靶點;淺藍色代表各個藥物;綠色代表苦參有效成分;金黃色代表虎杖有效成分;淺紫色代表黃芪有效成分;深紫色代表菟絲子有效成分;藍紫色代表益母草有效成分Blue-green represents the active ingredient target; Red represents drug intersection targets; Light blue represents individual drugs; Green represents the active ingredient of Sophora; The golden yellow color represents the active ingredient of knotweed; Light purple represents the active ingredient of astragalus; The dark purple color represents the active ingredient of dodder seed; Blue-purple represents the active ingredient of motherwort

2.2 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎交集靶點Veen圖 通過篩選,去重,將得到的苦虎益母口服液基因靶點77個,疾病基因靶點1102個輸入微生信平臺,得到Veen圖(圖2),可看到交集靶點共有35個。包括雌激素受體1 (ESR1)、細胞周期調節因子(CCND1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)等。

圖2 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎韋恩圖

2.3 蛋白互作(PPI)網絡構建 將獲得的交集靶點輸入STRING數據庫,隱藏游離節點后下載其TSV文件并導入到Cytoscape 3.8.2軟件中進行可視化,該圖包括35個節點,130條邊,如圖3。排名前3的是ESR1、CCND1、VEGFA,分別與20、15、14個蛋白相互作用。Degree值越大,節點越大,顏色也越深,靶點越重要。

圖3 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎蛋白互作圖

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路分析 從DAVID數據庫中獲得GO功能富集分析85個條目,篩選符合偽發現率<0.05的條件后得到相關條目8個,繪制條形圖(圖4)。包括生物過程(biological process, BP)5個,細胞組分(cellular component, CC)1個,分子功能(molecular function, MF)2個。生物過程涉及到白細胞介素-18、巨噬細胞活化、免疫反應、細胞對異生刺激的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄正調;細胞組分涉及到細胞外間隙;分子功能涉及到干擾素-γ受體結合、細胞因子活性。

圖4 苦虎益母口服液GO功能富集分析圖

KEGG富集分析共得到通路18條,篩選符合偽發現率<0.05的條件后得到通路10條,繪制氣泡圖(圖5),涉及到細胞衰老、細胞周期、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、沙門氏菌感染、焦點粘連、FoxO信號通路、NOD樣受體信號通路、甲型流感、單純皰疹病毒1感染等通路。氣泡越大,富集到此條目的基因數越多,顏色越紅,該條目的偽發現率越低。

圖5 苦虎益母口服液KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對接 使用Autodock軟件將具有最高Degree值的3種活性成分包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin),與PPI網絡中的3種核心靶點,包括雌激素受體1 (ESR1)、細胞周期調節因子(CCND1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)對接。結果如表3,其中結合自由能最低的是CCND1-木犀草素(-6.34 kJ/mol),表明木犀草素可能通過CCND1作用進而治療雞輸卵管炎。配體與受體結合越穩定,兩者結合能越低。將結合能排名前3的分子對接結果進行可視化(圖6)。

表3 苦虎益母口服液有效成分分子對接結果(前3)

A,CCND1與木犀草素對接圖;B,CCND1與山奈酚對接圖;C,VEGFA與山奈酚對接圖A, CCND1 and luteolin docking diagram; B,CCND1 and kaempferol docking diagram; C,VEGFA and kaempferol docking diagram

3 討 論

苦虎益母口服液包括苦參、虎杖、黃芪、菟絲子、益母草五味中藥。其主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花素、異鼠李素、β-谷甾醇、7-O-甲基異木糖醇、苦參堿、虎杖苷等。基于網絡藥理學研究,發現其中Degree值排名最高的3種活性成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素,均屬于屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物是一類結構相對均一的化合物,具有保護生殖組織、抗炎、抗菌、抗氧化應激等作用[8］。槲皮素是五味藥材共有的成分,Degree值最大。槲皮素具有雌激素樣作用,能夠增加激素分泌,上調或下調凋亡基因的表達,從而促進生殖器官發育和抑制卵泡凋亡來提高生產性能[9］。此外槲皮素的抗氧化活性主要表現為環境和毒理因素對谷胱甘肽(GSH)、酶活性、信號轉導途徑和活性氧(ROS)的影響[10］。山柰酚可降低不同類型癌癥的發病率[11］,主要是通過增加細胞凋亡來抑制癌細胞的增殖來實現[12］。山奈酚能抑制細胞活力,在雞胚胎的脈絡膜尿囊膜中,山奈酚顯著抑制OVCAR-70誘導的血管生成和腫瘤生長[13］。木犀草素的抗炎活性包括抑制促炎介質(如COX-2、NO、IL-6、TNF-α)和調節幾種信號通路(NF-KB、AP-1和JAK-STAT),這些信號轉導通路通過串擾相互連接,木犀草素可以調節和抑制這些信號轉導通路,且木犀草素還具有強大的抗氧化能力,能清除自由基和保護細胞[14-15］。苦虎益母口服液可能通過多種有效活性成分調節機體炎癥反應、抗氧化和保護細胞等,達到治療雞輸卵管炎的目的。

PPI分析結果顯示,苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的靶點主要涉及ESR1、CCND1、VEGFA。雌激素受體(ER)是核受體超家族的成員,主要核受體為ESR1和ESR2[16］。配體結合后,ESR1復合物充當轉錄因子并與雌激素靶基因(例如PGR)的啟動子結合以誘導其表達[17］。ESR1在子宮內膜中的表達占主導地位,雌激素依賴性增殖主要通過ESR1介導[18］。ESR1在雞胚成纖維細胞(DF-1)細胞中的過表達上調了CYP19A1的蛋白表達,而形成協調CYP19A1表達的潛在調控網絡有助于CYP19A1在雞卵巢卵泡膜細胞中的中表達[19］。此外,ESR1的缺失還會影響傳出小管和附睪功能,阻礙離子運輸和水重吸收,導致精子異常[20］。CCND1是一種原癌基因,可調節細胞周期G1-S期的進展,細胞周期分析和增殖分析表明,CCND1的近端聚腺苷酸化位點加速了細胞周期并促進了細胞增殖[21］。CCND1誘導母體視網膜母細胞瘤1(RB1)蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,導致該蛋白的降解。這可能有助于胚層發育過程中母體到合子的過渡后細胞周期進程[22］。且CCND1主要在成年雄雞睪丸的生精小管內的Sertoli細胞核中表達,在Sertoli細胞的分化和睪丸發育過程中生精小管的形成中起重要作用。VEGFA是一個蛋白質家族的成員,在卵巢組織中研究廣泛[23］。VEGFA亞型的生物學效應由兩種酪氨酸激酶受體介導,即VEGFR1 (FLT1)和VEGFR2 (FLK1或KDR)[24］。VEGFA是血管生成最重要的調節因子之一,在血管生成和進展中起著至關重要的作用[25］。研究表明卵巢功能依賴于正常的鞘血管系統的建立,而VEGFA是鞘膜血管生成的主要調節因子,鞘血管損傷很可能是卵巢功能障礙的原因之一[26］。

GO富集分析表明,苦虎益母口服液主要通過白細胞介素-18、巨噬細胞活化、免疫反應、細胞對異生刺激的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄正調等生物過程對雞輸卵管炎發揮作用。KEGG富集通路分析表明,調節雞輸卵管炎的主要通路是細胞衰老、細胞周期、Toll樣受體信號通路。細胞衰老是一種應激反應,可引發永久性細胞周期停滯并引發深刻的表型變化,如產生生物活性分泌組,稱為衰老相關分泌表型(SASP)[27］。SASP持續誘導衰老,甚至在免疫系統受損時適度的衰老水平,可能導致衰老細胞的大量積累,從而引發慢性炎癥狀態,對鄰近細胞和整個生物體產生有害影響。SASP能夠激活免疫監視并招募適應性和先天免疫細胞來消除衰老細胞[28］。在衰老過程中,衰老細胞的積累超過了這些細胞的清除能力,并通過SASP相關分子的分泌,導致組織的慢性衰退[29］。細胞周期調節由蛋白質、酶、細胞因子和細胞周期信號通路之間的復雜相互作用網絡協調,對細胞增殖、生長和修復至關重要[30］。Toll樣受體(TLR)是定義明確的模式識別受體,負責病原體識別和誘導先天免疫反應,感知病原體相關的分子模式(例如脂多糖)并觸發基因表達變化,保護宿主免受細菌、病毒及其他微生物的侵害[31-32］。細菌脂多糖(LPS)是 toll樣受體4 (TLR4)的配體,誘導粘蛋白mRNA增強母雞陰道粘膜屏障,在蛋雞陰道中,LPS上調了粘蛋白的表達,這種粘蛋白表達系統可能在陰道黏膜抗感染的粘膜屏障中起作用[33］。

分子對接結果表明,苦虎益母口服液主要有效活性成分槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)與關鍵靶點雌激素受體1 (ESR1)、細胞周期調節因子(CCND1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)結合能均為負值,且構象穩定,結合活性良好。苦虎益母口服液的有效成分可能通過上述的關鍵靶點發揮治療雞輸卵管炎的作用。

綜上所述,苦虎益母口服液的活性成分,即槲皮素、木犀草素、山奈酚等,可能作用于ESR1、CCND1、VEGFA等多個靶點,調節細胞衰老、細胞周期、Toll樣受體信號等多種信號通路,抑制炎癥反應、抗炎、抗氧化應激,保護生殖組織,從而實現雞輸卵管炎的治療。研究采用網絡藥理學方法和分子對接技術,預測苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的作用機制,符合中藥的組方原則,契合其“多組分、多靶點、多通路”的特點。上述研究也為其進一步的研究提供數據支撐和參考依據。