一株H1N1亞型豬流感病毒全基因組特征分析

張 傲,譚 斌,劉可欣,劉佳利,張淑琴

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長春 130112)

豬流感病毒(swine influenza virus,SIV)為正黏病毒科、A型流感病毒屬成員,可引起豬的急性、熱性、高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。目前,世界范圍內(nèi)主要存在的SIV包括H1N1、H1N2和H3N2亞型[1]。豬流感病毒變異速度快,由于豬呼吸道黏膜上皮細胞表面同時存在禽流感病毒和人流感病毒的唾液酸受體,使得不同來源的流感病毒可在豬體內(nèi)進行基因重排,產(chǎn)生具有新的感染性、致病性及傳播性的基因重排毒株,不僅給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,并且對公共衛(wèi)生造成了嚴重危害[2-5]。因此,加強對SIV的流行病學(xué)調(diào)查,及時掌握SIV的生物學(xué)特性及流行情況,不僅對SIV的預(yù)防和控制具有重要作用,更具有深遠的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究在吉林地區(qū)某豬場分離得到一株H1N1亞型SIV,通過對該分離株進行全基因組特征分析,了解SIV在吉林地區(qū)豬場中的流行情況,為我國豬流感防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

犬腎細胞(MDCK)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存;SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司;Trizol購自莫納(長春)生物科技有限公司;DNA Marker、Trans1-T1感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司;PCR試劑、克隆載體pMD18-T均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒的分離鑒定

將采集的鼻拭子加入1 mL雙抗PBS溶液(2 000 U·mL-1)稀釋震蕩,在4 ℃條件下8 000 r·min-1離心10 min,取上清以0.22 μm濾膜濾過除菌,接種于9～10日齡SPF雞胚尿囊腔中,37 ℃培養(yǎng)72 h后收集雞胚尿囊液。按照上述方法將尿囊液再次接種雞胚盲傳2代,收集第3代尿囊液進行紅細胞凝集試驗,測定其對1%雞紅細胞的凝集活性并通過RT-PCR鑒定SIV。對鑒定結(jié)果呈陽性的尿囊液參照GB/T 27521—2011豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法對分離病毒進行PCR分型鑒定,并按照Reed-Muench法測定病毒的TCID50。

1.3 病毒全基因組擴增及特征分析

根據(jù)GenBank查詢到的H1N1亞型SIV基因序列信息,通過比對參考毒株的全基因組序列,設(shè)計擴增引物。應(yīng)用Trizol提取分離株的RNA,通過RT- PCR擴增全基因序列并連接至pMD18-T載體后送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序結(jié)果采用BLAST和MegAlign進行序列比對及同源性分析,運用MEGAX繪制系統(tǒng)進化樹,NetNGlyc-1.0分析預(yù)測潛在糖基化位點。

1.4 吉林省H1N1 SIV的選擇壓力分析

根據(jù)NCBI查詢到的全部吉林省H1N1亞型SIV基因序列信息,結(jié)合分離株的基因序列,采用Datamonkey中的SLAC(Singlelikelihood ancestor counting)及MEME(mixed effects model of evolution)方法計算每個密碼子的非同義替換(dN)與同義替換(dS),分析吉林省H1N1 SIVNA和HA基因的選擇壓力、陰性選擇位點和陽性選擇位點。毒株檢索時間區(qū)間為2008—2022年,數(shù)據(jù)庫采集數(shù)據(jù)時間為2023年3月9日。P<0.1時,SLAC和MEME的計算結(jié)果具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離鑒定

收獲雞胚尿囊液進行紅細胞凝集試驗,結(jié)果顯示,有12份雞胚尿囊液具有血凝性,其中最高血凝價為1∶128。取最高血凝價分離毒株進行后續(xù)試驗,將該毒株命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。利用亞型鑒定引物對分離病毒進行PCR分型鑒定,結(jié)果顯示分離株為H1N1亞型SIV。TCID50測定結(jié)果顯示分離株在MDCK 細胞上的TCID50為10-4.88·mL-1。

2.2 病毒全基因組序列特征分析

2.2.1 病毒全基因組同源性分析 分離株全基因組的8個基因節(jié)段(GenBank登錄號為OQ740141～OQ740148)與GenBank登錄的基因序列比對結(jié)果顯示,HA基因與A/turkey/IA/21089-3/1992(H1N1)核苷酸相似性為98.94%;NA基因與A/swine/Iowa/24297/1991(H1N1)核苷酸相似性為99.29%。內(nèi)部基因PB2、PA、NP、M、NS基因與2008年在中國出現(xiàn)的A/swine/Hubei/02/2008(H1N1)病毒具有高度相似性,核苷酸序列相似性為98.58%～99.64%;PB1基因與A/swine/Iowa/24297/1991(H1N1)核苷酸相似性最高,為99.49%。

2.2.2 HA 序列分析 HA蛋白由SIV第4節(jié)段的RNA編碼,其開放閱讀框(open reading frame,ORF)全長為1 701 bp,共編碼566個氨基酸,其中HA1由326個氨基酸組成,HA2由223個氨基酸組成。利用SignalP 4.0信號肽預(yù)測軟件對分離株HA蛋白進行信號肽預(yù)測,結(jié)果顯示HA信號肽序列位于1～17位氨基酸。經(jīng)Lasergene分析,HA基因的裂解位點位于339～347位氨基酸處,序列為339PSIQSR↓GLF347,該位點未發(fā)生氨基酸突變或插入,符合低致病性SIV的分子特征。利用NetNGlyc-1.0預(yù)測HA潛在糖基化位點,結(jié)果顯示HA蛋白具有6個潛在的糖基化位點,分別為28NSTD、40NVTV、104NGTC、304NTSL、498NGTY和557NGSL。

2.2.3 NA 序列分析 NA蛋白由SIV第6節(jié)段的RNA編碼,其ORF全長為1 410 bp,共編碼470個氨基酸。其潛在糖基化位點有6個,分別為44NHSE、63NOTY、68NISN、88NSSL、146NGTV和235NGSC。通過對NA氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),分離株出現(xiàn)H275K抗神經(jīng)氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitor,NAI)耐藥性相關(guān)氨基酸位點突變,表明該病毒可能對奧司他韋(oseltamivir)等NAI具有抗藥性[6-7]。

2.2.4 病毒HA基因和NA基因遺傳進化分析 將分離株的8個基因節(jié)段核苷酸序列與GenBank中的經(jīng)典型H1N1、歐亞類禽型H1N1、類人型H1N1和2009H1N1分支代表毒株進行比對分析(圖1)。結(jié)果顯示,分離株的全基因組均屬于經(jīng)典型H1N1進化分支,未出現(xiàn)流感病毒不同基因型之間的基因重排。

2.2.5 分離株功能性氨基酸位點突變分析 對分離株進行功能性氨基酸位點突變分析,毒株出現(xiàn)SIV致病性、毒力及復(fù)制能力增強的相關(guān)位點突變,結(jié)果見表1。

2.3 吉林省H1N1 SIV的選擇壓力分析

通過SLAC和MEME方法對NCBI檢索到的吉林省現(xiàn)有H1N1 SIV毒株及本研究分離得到的H1N1 SIV進行選擇壓力分析,HA篩選出4個正向選擇位點及20個負向選擇位點,NA篩選出6個正向選擇位點及11個負向選擇位點,二者的選擇壓力分別為0.123和0.138,結(jié)果見表2。SIVHA和NA基因在吉林省的自主變異進化明顯,NA的突變率高于HA。

3 討 論

SIV可引起豬的高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病,該病毒的傳播給我國畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,并對人類構(gòu)成潛在的大流行威脅。自1918年以來,經(jīng)典型H1N1 SIV在豬群中傳播并以重組的形式在人類中出現(xiàn),導(dǎo)致了2009年H1N1流感大流行[8]。本研究對分離出的經(jīng)典型H1N1 SIV全基因組進行了系統(tǒng)分析,并對吉林省H1N1 SIV的選擇壓力進行了分析評估。

之前的研究報道中指出,直至1998年,經(jīng)典型H1N1 SIV作為主要的流行毒株在北美豬群中持續(xù)傳播。在1918—1919年大流行期間,經(jīng)典型H1N1 SIV可能由北美傳播至中國沿海城市的豬群中,該病毒于1991年首次從中國大陸分離出來,流感監(jiān)測分析顯示,自1996年以來,我國豬群中經(jīng)常分離出經(jīng)典型H1N1 SIV[9-10]。本研究于2008年在吉林地區(qū)分離得到一株經(jīng)典型H1N1 SIV,并命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該病毒與此前在北美和中國分離的經(jīng)典型H1N1病毒有著密切的親緣關(guān)系,這表明它們可能屬于同一進化分支,與之前流感病毒研究與監(jiān)測分析結(jié)果相一致。

先前的研究表明,H1N1亞型SIV對NAI具有高耐藥性的突變?yōu)镠275Y,該位點突變使NA活性位點結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并降低了NAI與NA的結(jié)合[7-8]。本研究中分離株出現(xiàn)H1N1亞型SIV NAI高耐藥性氨基酸位點突變,表明該病毒可能對奧司他韋等NAI具有抗藥性。目前,僅有少數(shù)毒株具有神經(jīng)氨酸酶抑制性突變,故該毒株的序列分析對后續(xù)抗流感藥物研究具有參考意義。

由于SIV聚合酶復(fù)合物缺乏校對活性,HA和NA基因易發(fā)生點突變,常以dN/ dS評估氨基酸位點所受的自然選擇壓力[11]。自發(fā)突變在負向選擇壓力下會被清除,而在正向選擇壓力下則可以積累并穩(wěn)定遺傳,導(dǎo)致蛋白功能的變化。本研究篩選出

HA基因及NA基因較多的負向選擇位點表明SIVHA和NA基因在吉林省的自主變異進化明顯,已超越免疫選擇壓力的作用。在我國豬的壽命約為6個月,且豬場幾乎不使用流感疫苗,流感病毒被引入豬體內(nèi)后,病毒所受的免疫選擇壓力較小。因此,這些基因的自主變異進化會超越免疫選擇壓力的作用,導(dǎo)致其進化速度比人類和禽類流感病毒慢。

表1 分離株功能性氨基酸位點突變分析Table 1 Analysis of functional amino acid mutations of the SIV isolates

表2 吉林省H1N1 SIVs的選擇壓力分析Table 2 Analysis of the selection pressure of Jilin H1N1 SIVs

4 結(jié) 論

本研究成功分離出一株SIV,通過對分離株全基因組進行系統(tǒng)分析確認該毒株為經(jīng)典型H1N1 SIV,并命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。本研究獲得的H1N1亞型SIV分離株全基因組序列分析結(jié)果對SIV流行病學(xué)調(diào)查及后續(xù)疫苗研發(fā)具有一定意義。