豬傳染性胃腸炎病毒感染仔豬免疫器官的組織病理學觀察

賀葉青,左百姣,李慶豪,孫 娟,金 鑫,夏 璐*,魏戰勇

(1.河南農業大學動物醫學院,鄭州 450046;2.動物病原與生物安全教育部重點實驗室,鄭州 450046)

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridaefamily)、α冠狀病毒屬(Alphacoronaviruses)成員,是引起仔豬腹瀉的重要病原[1]。1946年Doyle等首次發現該病毒是引起豬傳染性胃腸炎的病原,隨后該疾病在許多國家暴發[2]。我國于1956年發現該病,并在多個省份相繼報道[3]。TGEV感染通常發生在寒冷季節,如冬季和早春,主要引起2周齡以內仔豬發生嘔吐、腹瀉和脫水,對仔豬的致死率高達100%,給養豬業造成巨大的經濟損失。目前疫苗接種是防控TGEV感染的主要措施,但是近年來隨著TGEV變異株的出現,使該病無法得到有效控制[4]。

研究表明,TGEV感染仔豬主要引起消化系統癥狀,導致空腸和回腸絨毛萎縮甚至脫落,腸壁滲透壓失衡而腹瀉脫水。最新研究發現變異的TGEV還可以感染呼吸道,在仔豬肺泡巨噬細胞中復制,造成肺的廣泛損傷[5]。

目前關于TGEV組織嗜性的研究大多集中在感染仔豬的腸道。研究發現被感染仔豬回腸派伊爾氏結區域明顯縮小,sIgA陽性細胞、CD3+T細胞和樹突狀細胞數量顯著降低,并且在淋巴細胞、巨噬細胞中檢測到有病毒顆粒分布,提示TGEV還可感染仔豬的免疫系統[6]。因此,本文對TGEV感染后仔豬的免疫系統進行全面、深入研究,不僅為TGEV的免疫致病機制提供理論依據,同時也對該病的診斷、防治提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 從河南某豬場購買10只健康狀況良好的5日齡仔豬,試驗前經反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測仔豬糞便中TGEV、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等常見豬腹瀉傳染病原核酸陰性,采集仔豬血清酶聯免疫吸附試驗檢測仔豬血清中TGEV抗體陰性。

1.1.2 病毒、抗體及主要試劑 TGEV HN-2012毒株由河南省動物源性食品安全重點實驗室制備和保存;TGEV N蛋白單克隆抗體由江蘇省農業科學院李彬研究員饋贈;(鼠/兔)SP試劑盒(貨號KIT-9720)、AEC顯色試劑盒(貨號AEC-0037),購自福州邁新生物技術開發有限公司;檸檬酸鈉抗原修復液(貨號C1010),購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和感染試驗 10頭5日齡健康仔豬隨機分為空白對照組和TGEV感染組,每組5頭,分別飼養在兩個不同的封閉豬舍內,每隔6 h人工喂奶。感染組仔豬口服10 mL TGEV(TCID50為107·0.1 mL-1),空白對照組仔豬口服相同體積的DMEM培養基,仔豬在感染5 d后逐一進行安樂死剖殺。所有動物試驗程序均按照河南農業大學動物倫理與使用委員會的指導方針進行。

1.2.2 樣品采集與處理 仔豬處死后,分別采集仔豬的中樞免疫器官(胸腺)和外周免疫器官(脾、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、髂下淋巴結、頸淺淋巴結、下頜淋巴結),一式三份,固定在40 g·L-1多聚甲醛中以備后續使用。

1.2.3 組織切片的制備 仔豬的各臟器固定48 h后,從多聚甲醛中取出修塊,放入包埋盒中流水沖洗過夜,然后依次按照梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、石蠟切片機切片的過程處理,最后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色。

1.2.4 HE染色 為了解TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化,對免疫系統的各組織樣品進行HE染色。制作好的石蠟切片依次經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后,用HE染色,中性樹膠封片后進行觀察和分析。

1.2.5 免疫組化染色 為了分析TGEV在仔豬免疫系統中的分布,用TGEV N蛋白單克隆抗體進行染色。采集的各組織經脫蠟、水化和流水沖洗后,用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)對組織進行抗原修復,過氧化氫溶液室溫孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶的干擾,50 g·L-1牛血清白蛋白溶液室溫封閉10 min阻斷抗體的非特異性結合。接著,將TGEV N蛋白單克隆抗體(1∶500)在4 ℃條件下孵育過夜,生物素標記的羊抗小鼠IgG聚合物與樣本室溫孵育10 min,鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶室溫孵育10 min,最后用AEC顯色試劑盒對樣品進行顯色。

2 結 果

2.1 組織病理學分析

2.1.1 中樞免疫器官的病理變化 胸腺組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬胸腺的結構未見異常,皮質和髓質邊界清晰,胸腺小體清晰可見(圖1A);TGEV感染組仔豬胸腺髓質區域增大,淋巴細胞減少(圖1B)。

2.1.2 外周免疫器官的病理變化 脾組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬脾的結構未見異常,紅髓、白髓和邊緣區結構清晰,淋巴細胞染色正常(圖2A);TGEV感染組仔豬脾被膜和小梁增厚,紅髓增多,脾索和脾竇界限不清晰,淋巴細胞減少,紅髓中有大量紅細胞浸潤(圖2B)。

扁桃體組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬扁桃體的結構未見異常,扁桃體被膜、結締組織和淋巴濾泡染色清晰(圖2C);TGEV感染組仔豬扁桃體細胞淡染,淋巴濾泡和淋巴細胞均減少(圖2D)。

淋巴結組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬淋巴結結構未見異常,淋巴小結結構清晰完整(圖2E、2G、2I、2K和2M);TGEV感染組仔豬的淋巴結均有不同程度的損傷,顯微鏡觀察均可見淋巴結腫大,淋巴竇中有大量血細胞浸潤并伴有鐵銹色顆粒,提示巨噬細胞吞噬作用增強。頸淺淋巴結髓質中髓索和髓竇界限不清,髓竇中充滿淡紅色紅染物質(圖2F);腹股溝淋巴結可見淋巴細胞增生,呈團島狀分布,淋巴竇擴張,髓質的髓索變粗(圖2H);下頜淋巴結可見淋巴小結邊界模糊(圖2J);腸系膜淋巴結可見細胞淡染,淋巴細胞減少(圖2L);髂下淋巴結淋巴細胞增多,小梁增厚(圖2N)。

2.2 TGEV在仔豬免疫系統的分布

2.2.1 中樞免疫器官TGEV的分布 胸腺的IHC染色結果顯示,空白對照組仔豬胸腺未見明顯陽性著色(圖3A);TGEV感染組仔豬胸腺的被膜和皮質中看到少量特異性紅色著色點(圖3B)。

2.2.2 外周免疫器官TGEV的分布 脾組織的IHC染色結果顯示,空白對照組仔豬脾未見明顯陽性著色(圖4A);TGEV感染組仔豬脾紅髓和邊緣區可見大量淋巴細胞呈特異性紅色著色點(圖4B)。

扁桃體組織的IHC結果顯示,空白對照組仔豬扁桃體未見明顯陽性著色(圖4C);TGEV感染組仔豬扁桃體被膜下方的彌散淋巴組織呈特異性紅色著色點(圖4D)。

淋巴結組織的IHC結果顯示,空白對照組仔豬淋巴結未見明顯陽性著色(圖4E、4G、4I、4K和4M);TGEV感染組仔豬頸淺淋巴結和腹股溝淋巴結被膜下淺層皮質區有大量淋巴細胞呈特異性紅色著色點,大多分布在鐵銹色沉積周圍(圖4F和4H),下頜淋巴結可見淋巴小結周圍有特異性紅色著色點(圖4J),腸系膜淋巴結和髂下淋巴結淺層皮質區有少量特異性紅色著色點,與對照組對比不明顯(圖4L和4N)。

TGEV存在于多種免疫器官,病毒載量以脾為最高,其他器官病毒載量由高到低依次為頸淺淋巴結、腹股溝淋巴結、扁桃體、下頜淋巴結、腸系膜淋巴結、髂下淋巴結、胸腺(圖5)。

3 討 論

TGEV是一種腸致病性冠狀病毒,主要引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀,剖檢可見感染仔豬的胃中充滿著未消化的凝乳塊,腸壁明顯變薄,腸腔內充滿大量黃色液體內容物,同時伴有腸系淋巴結出血[7-9]。鏡檢發現TGEV感染主要引起仔豬腸絨毛萎縮,上皮細胞空泡化并出現脫落,最終導致仔豬的營養吸收障礙和腹瀉[7]。深入研究發現,TGEV主要感染仔豬的腸上皮細胞,包括腸細胞、干細胞和杯狀細胞[6]。目前,TGEV感染仔豬的相關研究大多集中于腸道,而TGEV對仔豬全身免疫系統影響的研究報道較少[10-11]。免疫系統是機體執行免疫功能的機構,在抵御病原微生物入侵機體中發揮重要作用。因此,開展TGEV對仔豬免疫系統的研究有助于全面了解該病毒的致病性,對臨床指導TGEV的防控具有重要的理論和實踐意義。本試驗通過HE染色對TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化進行分析,并且通過IHC染色檢測了病毒粒子在免疫器官內的分布。

HE結果表明,TGEV感染仔豬可引起中樞免疫器官免疫細胞減少;外周免疫器官腫大、出血,免疫細胞減少。相關研究發現TGEV感染后病豬脾腫大、充血,部分淋巴結腫脹、充血,顏色變深呈紫紅色[8]。引起仔豬腹瀉的豬腸道冠狀病毒還包括PEDV、PDCoV等。PEDV感染仔豬后也發現仔豬的免疫系統受到損傷,如免疫細胞減少,腸系膜淋巴結毛細血管充血或輕微出血,脾內有大量嗜酸性粒細胞浸潤[12]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發的新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)嚴重威脅人類健康。調查發現COVID-19患者免疫功能受損在臨床中表現非常突出,主要表現為脾體積明顯縮小,紅髓脾竇擴張、充血,白髓呈不同程度萎縮,嗜血細胞增多,中性粒細胞、漿細胞數量增多,嗜酸性粒細胞數量下降[13]。進一步研究發現,COVID-19患者外周血T淋巴細胞(CD4+和CD8+)過度激活,表現為CCR4+CCR6+Th17細胞的增加和CD8+T淋巴細胞的高細胞毒性,提示患者遭受了嚴重的免疫系統損傷[14]。上述結果表明冠狀病毒可以對機體的免疫系統造成損傷,今后應重視冠狀病毒對免疫系統的影響。

IHC的結果顯示,TGEV存在于多種免疫器官,并且脾中的病毒載量最高(圖8P)。間接免疫熒光方法也在仔豬腸系膜淋巴結中檢測到了TGEV[15]。RT-PCR方法也在仔豬的脾、扁桃體、腹股溝淋巴結等免疫器官內檢測到了PDCoV和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的存在[16-17]。IHC和原位雜交等方法也在COVID-19患者脾淋巴細胞和巨噬細胞內檢測到SARS-CoV-2[13]。這些研究說明了冠狀病毒可以感染免疫系統。豬氨肽酶N(porcine aminopeptidase N, pAPN)是TGEV感染的主要功能性受體[18]。TGEV分布于多個免疫器官,作者猜測這些免疫器官中存在pAPN的表達。作者還發現感染仔豬脾的紅髓中有大量血細胞浸潤,淋巴組織中有大量血細胞浸潤和鐵黃素沉積,推測TGEV感染仔豬后引起病毒血癥,通過血液循環,到達脾、淋巴結等免疫器官,促使機體啟動一系列免疫應答,造成免疫器官損傷。

綜上,TGEV感染仔豬后,引起各免疫器官不同程度的損傷,且在各免疫器官內均有TGEV分布,表明TGEV能夠感染仔豬免疫系統并引起仔豬各免疫器官組織損傷,降低機體的免疫功能。今后的研究中應關注豬腸道冠狀病毒對仔豬免疫系統的影響,在臨床治療中采取相應的干預措施。

4 結 論

TGEV感染損傷仔豬免疫器官,降低機體免疫功能。