雞傳染性支氣管炎病毒感染HD11細胞的轉(zhuǎn)錄組分析

陳 璐,常新宇,沈嘉忱,沈瑞廷,趙振華,侯曉林

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院,北京 102206)

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由IB病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的一種急性、高度傳染性呼吸道疾病,于20世紀30年代在美國首次被發(fā)現(xiàn),它是造成全球家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的最重要原因之一[1-2]。IBV主要引起禽類呼吸道疾病,此外,它也會導致腎炎、產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋品質(zhì)下降,甚至死亡[3]。由于基因突變和重組,不同的IBV毒株表現(xiàn)出不同的特性,在致病機制、毒力、年齡取向以及受體特異性方面存在差異,迄今為止,還沒有針對IBV感染有效藥物報道,接種疫苗也不足以提供完全的保護[4],因此IBV的防控還存在巨大挑戰(zhàn)[5]。

研究表明,宿主先天免疫在抵抗IBV中發(fā)揮重要作用,是機體保護的第一道防線。IBV進入宿主細胞,免疫系統(tǒng)識別產(chǎn)生抗病毒免疫。IBV天然免疫應答的研究受到越來越多的關(guān)注,了解感染早期宿主細胞對抗IBV發(fā)揮的作用具有重要研究意義。

本研究使用IBV Beaudette株感染雞巨噬細胞HD11,進行轉(zhuǎn)錄組學檢測分析,將差異表達基因按照功能進行分類,分析其參與的信號通路,了解IBV感染早期宿主細胞產(chǎn)生的抗病毒反應和免疫應答,為探究IBV的致病機制提供理論依據(jù),從而為疫苗開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒

雞巨噬細胞HD11購自中國科學院細胞庫(上海),IBV Beaudette株由四川農(nóng)業(yè)大學提供,現(xiàn)保存于北京農(nóng)學院基礎獸醫(yī)實驗室。

1.2 細胞培養(yǎng)與病毒感染

將對數(shù)生長期的HD11細胞鋪于6孔板中,當細胞匯合率達到80%左右時,感染100 TCID50的IBV,37 ℃、5%CO2孵育1 h后,棄去病毒液,加入2%維持培養(yǎng)基,2 h后收集細胞。病毒感染組命名為IBV-1、IBV-2、IBV-3,未感染病毒的細胞為對照組,分別命名為NC-1、NC-2、NC-3。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

Trizol法提取細胞總RNA,檢測合格后將RNA純化、片段化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit進行文庫構(gòu)建、Illumina NovaSeq6000上機測序分析[6]。

1.4 差異表達基因和模式識別受體的RT-qPCR驗證

為了驗證測序結(jié)果的準確性,隨機選擇10個與天然免疫、抗病毒反應相關(guān)的差異表達基因和3個模式識別受體基因進行RT-qPCR驗證(以β-Actin為內(nèi)參基因,引物由上海生工生物工程有限公司合成,詳見表1)。擴增條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,共40個循環(huán);熔解曲線分析:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計分析。將得到的Ct值按照2-△△Ct法計算相對表達量,GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達基因篩選

以P<0.05,|log2FC|≥1為標準篩選差異表達基因,共檢測到2 016個差異表達基因,其中1 363個基因表達上調(diào),653個基因表達下調(diào)。

2.2 GO注釋分析

GO注釋分析顯示,差異表達基因共分為細胞組分(cellular component,CC)、生物學過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)三大類,圖1為前20個顯著富集的二級條目。在CC分類中占比較大的為細胞成分、細胞器、細胞膜;BP分類中占比較大的為細胞過程、生物調(diào)節(jié)和代謝過程;MF分類中結(jié)合、催化活性和分子功能調(diào)節(jié)劑數(shù)量較多。

2.3 KEGG富集分析

KEGG 信號通路富集分析顯示,癌癥通路、細胞因子和細胞因子受體之間的相互作用、MAPK信號通路是富集到差異表達基因最多的前3個信號通路(圖2)。與免疫相關(guān)的MAPK信號通路中,主要有促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAP3K5)、TNF 受體關(guān)聯(lián)因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AREG)等,這些結(jié)果可以進一步為細胞抗IBV的天然免疫應答的研究提供理論基礎。

表1 差異表達基因RT-qPCR引物設計Table 1 Design of RT-qPCR primers for differentially expressed genes

圖1 差異表達基因GO注釋分析Fig.1 GO annotation analysis of differentially expressed genes

圖2 差異表達基因KEGG富集分析氣泡圖Fig.2 Bubble map of KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 RT-qPCR驗證

為了驗證測序結(jié)果的可靠性,任意選取10個與天然免疫、抗病毒反應有關(guān)的差異表達基因,以β-Actin為內(nèi)參基因,RT-qPCR檢測其相對表達水平。結(jié)果如圖3A所示,RT-qPCR的變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,IL10、IFNG、IL8、IL1β、CCL20上調(diào);CXCR4、CLP1、ALDOB、TNFSF10、CCR4下調(diào)。

本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中,模式識別受體基因MDA5、TLR3、TLR7轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比并無顯著性差異(圖3B)。

A. 差異表達基因的RT-qPCR驗證;B. 模式識別受體基因,ns. P>0.05A. Differentially expressed genes; B. Pattern recognition receptors genes, ns. P>0.05圖3 差異表達基因和模式識別受體基因的RT-qPCR驗證Fig.3 Verification of differentially expressed genes and pattern recognition receptors genes by RT-qPCR

3 討 論

模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)是宿主先天免疫的重要組成部分,例如MDA5、TLR3、TLR7等,它們可以識別IBV復制產(chǎn)生的雙鏈RNA和單鏈RNA,然后通過信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生干擾素、促炎細胞因子,抑制IBV的復制[7-8]。本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中,MDA5、TLR3、TLR7轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比并無顯著性差異(圖3B),推測可能由于感染時間過短,IBV還未處于復制階段,PRRs沒有開始識別病毒。

通過對差異表達基因進行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因富集最顯著的信號通路是細胞因子和細胞因子受體之間的相互作用,其中包括CCR4、IL8、IL1β、CCL20等參與免疫反應的基因,其中CXCR4在協(xié)調(diào)免疫反應方面發(fā)揮突出作用,它可以調(diào)節(jié)白細胞的運輸和分布,與CCR5共同促進免疫突觸的形成和穩(wěn)定來支持T細胞啟動[9-11]。TNF信號通路、MAPK信號通路也發(fā)生了顯著的變化,TNF是炎癥和免疫反應的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子,它能夠與受體TNF-R1相互作用激活不同的信號轉(zhuǎn)導途徑[12],富集到的TNF信號通路有34個差異表達基因,其中包括IRF1、TNFRSF1A、TRAF1、TRAF3等。MAPK能夠?qū)⒓毎砻娴男盘杺鬟f給細胞核內(nèi)部,MAPK信號轉(zhuǎn)導作為一種高度保守的信號通路參與各種生物事件[13]。TRAF6是一種連接蛋白,它可以直接激活MAPK信號通路[14]。本研究中,TRAF6在IBV感染2 h后顯著上調(diào),提示它在參與細胞的免疫反應中發(fā)揮了重要作用。

此次分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)差異表達基因與免疫調(diào)控有關(guān),表明細胞感染后通過調(diào)控免疫因子發(fā)揮抗病毒效應。例如JAK-STAT調(diào)節(jié)代謝過程信號通路幾乎介導所有的免疫調(diào)節(jié)過程[15]。Toll樣信號通路能夠識別保守的微生物結(jié)構(gòu),哺乳動物的Toll樣受體還誘導多種效應分子,直接破壞微生物病原體[16-17]。

綜上所述,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了IBV感染HD11細胞后參與免疫應答、抗病毒的相關(guān)基因,這些差異表達基因可能與IBV的致病機制或細胞的抗病毒反應有關(guān)。這將為研究IBV的防治提供一定的理論基礎。

4 結(jié) 論

IBV感染HD11細胞后,感染組篩選出1 363個上調(diào)基因,653個下調(diào)基因,進一步GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)IBV感染HD11細胞早期,差異表達基因大多與免疫反應、抗病毒作用有關(guān),富集到的信號通路主要集中在細胞因子和細胞因子受體之間的相互作用、病毒蛋白與細胞因子或細胞因子受體之間的相互作用、TNF信號通路、MAPK信號通路等。本研究有助于探究IBV致病機制和感染早期宿主細胞免疫反應。