舒心通脈湯對病毒性心肌炎患者自噬相關通路的影響*

趙小松，呂正祥，楊德忠

1 重慶市江津區中醫院，重慶 404100； 2 陸軍軍醫大學大坪醫院，重慶 400042

根據世界衛生組織（world health organization，WHO）心肌病分類，病毒性心肌炎屬炎癥性疾病，其是部分年輕患者心源性猝死和擴張性心肌病發生的重要原因［1］。研究表明，病毒如B型柯薩奇病毒或腺病毒感染機體后，可直接損傷心肌，造成病理性炎癥反應［2］。同時病毒可利用自噬逃避降解，促進病毒的復制及獲取代謝產物，同時過度激活的自噬還可促進細胞凋亡及炎癥級聯反應［3］，因此，自噬可能是病毒性心肌炎發生及發展的關鍵分子事件。針對病毒性心肌炎患者，如何有效地抑制機體細胞自噬，可能是臨床研究及治療的重要方向。中醫認為，病毒性心肌炎屬“胸痹”“心悸”范疇，治療以活血化瘀、益氣通脈為主。以舒心通脈組分為代表的中藥方劑，可顯著改善心血管疾病，如慢性心衰患者的心功能［4］，但對于病毒性心肌炎自噬相關通路的影響，目前尚無相關研究報道。本研究通過探討舒心通脈湯對病毒性心肌炎患者外周血單核細胞自噬相關基因、凋亡及炎性因子的影響，為其臨床運用提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018 年8 月至2020 年8 月重慶市江津區中醫院收治的126 例成年病毒性心肌炎患者為研究對象。按隨機數字表法分為對照組和觀察組，每組63 例。觀察組中男33 例，女30例；平均年齡（45.6±9.3）歲；平均病程（9.8±2.8）天；心功能分級：Ⅰ～Ⅱ級50 例，Ⅲ～Ⅳ級13 例。對照組中男35例，女28例；平均年齡（46.3±8.5）歲；平均病程（10.5±3.1）天；心功能分級：Ⅰ～Ⅱ級52 例，Ⅲ～Ⅳ級11 例。兩組基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標準納入：1）符合病毒性心肌炎診斷與治療指南［5］者；2）年齡＞18歲者；3）獲得了醫院倫理委員會的批準（AM180801），且簽署知情同意書者。

1.3 排除標準排除：1）合并細菌引起的感染性心內膜炎、惡性腫瘤、嚴重器官功能不全者；2）對舒心通脈湯過敏者；3）治療依從性較差者。

1.4 治療方法1）對照組采用常規治療方案，即入院當日給予休息、吸氧、抗病毒、營養心肌［維生素C（東北制藥，批準文號：國藥準字H21020713，規格：0.1 g/片）、鹽酸曲美他嗪（遠大醫藥，批準文號：國藥準字H20083806，規格：20 mg/片）及輔酶Q10 膠囊（普康藥業，批準文號：國藥準字H19999355，規格：10 mg/粒）］、極化液穩定心電活動等對癥治療。2）觀察組在對照組的基礎上服用舒心通脈湯治療，藥物組成：黃芪20 g，西洋參15 g，丹參15 g，當歸、川芎、麥冬、金銀花、連翹各10 g。水煎早晚分服。兩組連續治療2個療程（1 個療程為14 天），治療期間禁煙禁酒，禁食辛辣、油膩食物。

1.5 觀察指標

1.5.1 自噬及凋亡相關基因mRNA 水平 收集患者治療后外周血單核細胞，提取總RNA，然后進行逆轉錄，逆轉錄方法按試劑盒說明（Takara 公司），qPCR引物由上海生工公司合成。引物序列見表1。建立20 μL反應體系，包括1 μL cDNA，2 μL 10X Taq 緩沖液，1.2 μL 25 mM MgCl2、0.4 μL 10 mM dNTP，0.8μL 1U/μLTaq 聚合酶，每個引物1 μL和剩余的加入DEPC水使反應總量達到20 μL。PCR 反應條件如下：95 ℃ 3min，在95 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s 和72 ℃ 40 s，共計30 個循環。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCq方法計算相對mRNA水平。

表1 引物序列表

1.5.2 自噬相關蛋白表達水平 提取患者治療前后單核細胞，經裂解液裂解后，測定蛋白濃度。然后進行電泳分離，電泳完成后轉移置硝基纖維素膜。采用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，然后與稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，抗Beclin-1 抗體（1∶400）、抗LC3 抗體（1∶300）及抗GAPDH 抗體（1∶500）。次日經磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后，將膜與孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。以GAPDH 為內參，計算目的條帶與GAPDH 灰度比值。

1.5.3 外周血炎性指標 采用ELISA 法測定不同組間外周血白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素22（interleukin-22，IL-22）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，檢測步驟按試劑盒說明書進行（南京建成生物公司）。

1.5.4 臨床療效 臨床痊愈：患者臨床癥狀、體征均消失，心肌損傷標志物和心電圖等檢查指標均恢復正常；顯效：患者臨床癥狀和體征完全消失或基本消失，心肌損傷標志物指標好轉，肌鈣蛋白為陰性；有效：患者臨床癥狀和體征有所好轉，同時心電圖、心肌損傷標志物有改善，但未恢復正常；無效：患者臨床癥狀和體征、心肌損傷標志物和心電圖等檢查指標未見明顯好轉甚至出現加重。

總有效率（%）=（痊愈+顯效+有效）例數/總例數

1.5.5 不良反應 觀察兩組患者治療過程中惡心、嘔吐、頭暈、乏力、腹瀉等不良反應的發生情況。

1.6 統計學方法采用SPSS 19.0 進行數據分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以n，%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血自噬相關基因mRNA 和蛋白表達水平與治療前比較，兩組治療后外周血單核細胞自噬相關基因Beclin-1、LC3-II mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），其中觀察組上述指標較對照組治療后降低更明顯（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組治療前后自噬相關基因mRNA及蛋白表達水平比較（±s）

表2 兩組治療前后自噬相關基因mRNA及蛋白表達水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組LC3-Ⅱ1.02±0.05 0.66±0.12*#0.98±0.04 0.77±0.10*例數63對照組63時間治療前治療后治療前治療后Beclin-1 mRNA 0.98±0.05 0.60±0.16*#0.99±0.06 0.78±0.10*Beclin-1 1.03±0.04 0.70±0.08*#1.01±0.02 0.80±0.09*LC3-Ⅱ mRNA 1.00±0.03 0.69±0.15*#1.02±0.04 0.82±0.11*

2.2 外周血炎性指標水平與治療前比較，兩組治療后外周血炎性指標IL-1β、IL-22 及TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.05），其中觀察組上述指標較對照組治療后降低更明顯（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后外周血炎性指標水平比較（±s） pg/mL

表3 兩組治療前后外周血炎性指標水平比較（±s） pg/mL

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組例數63對照組63時間治療前治療后治療前治療后IL-1β 26.28±6.15 12.65±3.87*#25.57±5.43 IL-22 33.98±4.97 14.72±4.02*#34.21±5.86 17.74±4.16*20.84±5.04*TNF-α 38.50±5.53 19.30±4.14*#39.01±6.02 24.22±4.95*

2.3 外周血單核細胞凋亡相關基因mRNA水平與治療前比較，兩組治療后外周血Caspase-3 mRNA水平明顯降低，Bcl-2 mRNA水平明顯升高（P＜0.05），其中觀察組Caspase-3 mRNA 及Bcl-2 mRNA 水平較對照組改善更明顯（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組外周血單核細胞凋亡相關基因mRNA水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

Bcl-2 mRNA 1.00±0.03 1.35±0.11*#1.01±0.04 1.20±0.07*組別觀察組例數63 Caspase-3 mRNA 0.99±0.06對照組63時間治療前治療后治療前治療后0.75±0.10*#1.01±0.05 0.83±0.09*

2.4 臨床療效觀察組痊愈32例，顯效16例，有效11 例，無效4 例，總有效率93.7%（59/63）；對照組痊愈25例，顯效16例，有效10例，無效12例，總有效率81.0%（51/63）。觀察組總有效率高于對照組（P＜0.05）。

2.5 不良反應發生率治療期間觀察組發生不良反應發4 例（6.35%），其中頭暈1 例、惡心2 例、嘔吐1例，對照組發生不良反應發2例（3.17%），其中頭暈1例、乏力1例。觀察組不良反應發生率稍高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者不良反應均較輕微，未經特殊處理癥狀均自行消失。

3 討論

病毒性心肌炎是臨床常見和多發的心血管疾病之一，臨床表現及病情呈現多樣化，大部分患者臨床癥狀不明顯，預后較好，但少部分患者可出現多種心律失常甚至心源性猝死等。隨著相關基礎及臨床研究的深入，臨床上對于病毒性心肌炎的防治均取得了顯著進展，若出現機體炎癥，給予大劑量激素沖擊療法；若患者免疫力低下，給予輸注免疫球蛋白；部分重癥患者甚至可給予體外肺氧合來維持患者呼吸與循環穩定。傳統中醫認為病毒性心肌炎屬“胸痹”“怔忡”范疇，發病源于氣陰兩虛、熱毒傷心，治療時以益氣養陰、活血化瘀為主［6］。相關研究顯示，舒心通脈方可改善心功能，提高心血管疾病患者臨床療效［7］，已運用于臨床，但具體機制還有待闡明。

近年來，對自噬在疾病發生、發展中的作用，醫學界已進行了廣泛而深入的研究。自噬通過吞噬并降解細胞質蛋白或受損的細胞器，對于促進細胞代謝，維持細胞器更新及機體穩態，起著重要的作用［8］。但自噬在不同疾病中扮演的作用有所不同，如在慢性阻塞性肺疾病［9］、動脈粥樣硬化［10］中，機體細胞自噬往往降低，而惡性腫瘤［11］患者，機體細胞自噬水平顯著增加，有助于腫瘤細胞免疫逃逸。對于病毒性心肌炎患者，目前自噬相關研究較少，但動物模型結果顯示，在病毒感染過程中，病毒可利用自噬逃避降解，促進病毒復制和釋放［12］。同時自噬還可促進細胞凋亡，產生炎癥級聯反應，導致重要臟器功能不全［13］。如何有效抑制病毒性心肌炎患者過度的細胞自噬反應，有可能成為該病有效治療的靶點。

舒心通絡湯由黃芪、西洋參、麥冬等組成，可針對患者正氣虛弱、血瘀氣滯，進行辨證施治。有研究顯示，黃芪除了具有調節機體免疫力作用外，還發揮抗氧化，保護器官缺血再灌注損傷的作用［14］。西洋參具有降低心肌耗氧量，提高缺氧耐受力，穩定心電活動的作用［15］。因此，舒心通脈湯諸多成分通過益氣養陰、抗炎、調節免疫等作用，提高機體抵抗不良因素刺激造成損傷的能力。

本研究觀察舒心通脈湯對病毒性心肌炎患者自噬、凋亡相關基因及外周血炎性指標的影響，其結果顯示，舒心通脈湯可顯著降低病毒性心肌炎細胞自噬及凋亡水平。有研究證實，過度的自噬可誘發細胞凋亡，線粒體依賴性途徑是細胞凋亡的重要機制，自噬通過對線粒體的大量降解，抑制了機體能量代謝，促進了細胞凋亡及相關促炎細胞因子的合成與分泌［16］。舒心通脈湯通過抑制病毒性心肌炎患者機體自噬和凋亡水平，有助于降低炎癥反應，提高臨床療效。同時作為純中藥方劑，舒心通脈湯對病毒性心肌炎患者尚未產生明顯的不良反應，安全性較好。

綜上所述，舒心通脈湯對病毒性心肌炎患者具有顯著的臨床療效，其機制可能與降低細胞自噬及凋亡，減輕炎癥反應有關。但舒心通脈湯對自噬的具體調控機制還有待于進一步研究。