補骨脂-淫羊藿藥對抗絕經后骨質疏松癥的網絡藥理學分析*

楊巖冰，郭云鵬，柴 爽

河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院），河南 鄭州 450016

中醫古籍中無絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）之名的記載，但“骨痿”“骨枯”等的描述與之十分相似［1-2］。最新的專家共識根據PMOP 的臨床癥狀、體征及定性、定位，認為其當屬“骨痿”，辨證分型為脾腎陽虛證、肝腎陰虛證和腎虛血瘀證，其中，推薦腎虛血瘀證患者使用成藥壯骨止痛膠囊［3］。壯骨止痛膠囊的藥物組成包括補骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補、狗脊和川牛膝等7 味藥物，前期已開展了全方（壯骨止痛方）的作用機制研究［4-6］，組方合理性的分析［7-8］及拆方分析［9-12］，發現補骨脂-淫羊藿藥對可提高去卵巢大鼠腰椎骨密度，改善骨生物力學特性，提高血清雌二醇水平。由于補骨脂-淫羊藿是PMOP 治療中常用的藥對，研究其作用機制具有重要意義，故本研究采用網絡藥理學的方法探討補骨脂-淫羊藿藥對抗PMOP的機制。

1 資料與方法

1.1 補骨脂、淫羊藿有效成分篩選及靶蛋白預測利用TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/）［11］，TCM Database@Taiwan 數據庫（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）［13］和BATAMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）［14］檢索補骨脂和淫羊藿的成分，本次主要研究口服給藥后補骨脂-淫羊藿藥對的作用機制，故通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）兩個指標篩選有效成分，設置OB＞30%，DL＞0.18 為有效成分篩選標準，在BATAMANTCM 數據庫中設置評分＞80 為篩選標準［15］，綜合獲取補骨脂-淫羊藿藥對的有效成分。利用以上各個數據庫的相關預測模塊，預測有效成分的靶蛋白。

1.2 PMOP 相關蛋白的檢索利用GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/），OMIM 數據庫（https：//omim.org/），GKB 數據庫（https：//www.pharmgkb.org/），TTD 數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），以“Postmenopausal Osteoporosis”“Osteoporosis，Postmenopausal”為檢索詞，檢索各數據庫中PMOP的相關蛋白和基因。

1.3 補骨脂、淫羊藿有效成分靶蛋白和PMOP 相關蛋白的標準化處理利用UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/），將物種限定為“Human”，檢索補骨脂-淫羊藿藥對有效成分靶蛋白和PMOP相關蛋白對應的官方名稱，并記錄ID編碼。檢索PMOP 相關蛋白的ID 編碼并記錄。這樣統一采用UniProt 數據庫的官方名稱和ID 編碼，便于后續進行分析。

1.4 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標篩選利用在線繪圖軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP的共同靶標，并繪制韋恩圖。

1.5 相互作用網絡圖的構建通過使用Cytoscape 插件Network Analyzer 進行拓撲分析，讀取各個節點的中介中心度（betweenness centrality，BC）和節點度（degree）；使用Cytoscape插件Bisogenet進行可視化分析。

1.6 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標的富集分析Metascape（http：//metascape.org/）是一個在線基因功能注釋分析在線工具，可以同時執行功能注釋和富集分析。將“1.4”項篩選出的補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標輸入Meascape平臺，輸入物種和分析物種均選擇“H.sapiens（132）”，然后進行基因本體論（gene ontology，GO），京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，設定P＜0.05的條目被顯著富集。

2 結果

2.1 補骨脂、淫羊藿有效成分-靶蛋白網絡利用3 個數據庫共檢索出補骨脂-淫羊藿藥對已知的化學成分166 種，其中補骨脂36 種，淫羊藿130種。經過篩選共獲得有效成分51 種，其中補骨脂28種，淫羊藿23種。中藥的配伍使用依賴于多成分、多靶標和多途徑之間的協同作用［16］，因此我們收集了各數據庫中靶蛋白共611種，刪除UniProt數據庫中無法查詢到對應基因的和重復數據后，共獲得292種靶蛋白。見圖1。

圖1 中藥-有效成分-靶蛋白網絡圖

為了從系統和整體的角度進一步理解有效成分-靶蛋白網絡，我們首先使用Cytoscape構建網絡圖，發現該網絡共包含365個節點和638個邊，然后進行拓撲分析獲取各個節點的Degree，Degree 表示與此節點相互作用的節點數，其大小與BC 成正比，及依賴此節點的連接越多，此節點的核心性越強，因此我們選擇Degree＞5的節點構建網絡圖，如圖1所示，補骨脂-淫羊藿藥對共有21個有效成分與26 個靶蛋白相連，其中槲皮素（quercetin）與149 個靶蛋白相連，山柰酚（kaempferol）與61 個靶蛋白相連，木犀草素（luteolin）作用于56 個靶蛋白，異補骨脂甲素（isobavachin）和脫水淫羊藿素（anhydroicaritin）作用于36 個靶蛋白，處于核心位置。

2.2 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標的富集分析利用GeneCards數據庫收集PMOP相關蛋白963 個，OMIM 數據庫36 個，GKB 數據庫3 個，TTD數據庫3 個，共1005 個。刪除重復數據后共獲得964個PMOP相關蛋白。

利用UniProt 數據庫統一基因名稱后，篩選補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標并繪制韋恩圖，共有132 個共同靶標，見圖2。將這些共同靶標輸入Metascape 平臺進行GO，KEGG 富集分析。GO 分為細胞組分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF）和生物學過程（biological process，BP）3 個方面對基因的本質進行描述，進行基因GO 富集分析可以了解其在Gene Ontology 中的分布和在基因功能上的體現。如圖3A-C 所示，顯著富集到CC 的GO 條目有膜筏、膜微區、膜區、轉錄因子復合體、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合體；顯著富集到MF的GO條目有核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、轉錄因子結合、蛋白激酶結合；顯著富集到BP 的GO 條目有對有毒物質、有機環狀化合物、無機物、細胞外刺激和營養水平的反應。KEGG 富集分析如圖3D 所示，顯著富集的信號通路包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥的途徑、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、內分泌耐藥、PI3K-Akt信號通路。

圖2 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標

圖3 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標的富集分析

3 討論

PMOP 的特征是骨骼強度降低和骨骼脆性增加，這是由絕經后婦女的雌激素缺乏引起的。其主要并發癥是脆性骨折，導致疼痛，功能障礙，甚至死亡。這種疾病發病隱匿，只有在發生疼痛性骨折（例如股骨頸、脊柱、尺骨、橈骨、肱骨、肋骨和骨盆）后才被發現。骨折常常給人們帶來巨大的痛苦，嚴重限制了患者的生活質量［17］。因此，預防和治療PMOP 引起了廣泛的關注。目前標準的治療方法是改變生活方式，結合雙膦酸鹽藥物及補充鈣和維生素D，以減少破骨細胞驅動的骨吸收［18］。盡管這些藥物有效，但大多數藥物都有一些局限性和副作用，影響長期給藥和依從性［19］。中醫藥防治骨質疏松由來已久，多從“肝脾腎”三臟論治，用藥配伍多選補腎、健脾、活血中藥，尤以補腎多見，補骨脂、淫羊藿是常用的補腎壯骨藥物，藥理研究表明它們在治療生殖系統、骨質疏松、心血管系統等疾病中具有重要作用［20-23］，但其藥理學機制尚未得到系統和全面的發現。網絡藥理學是一種包括化學信息學，生物信息學，網絡生物學和傳統藥理學的綜合方法，提供了一種從系統和整體的角度揭示中藥配方的生物活性成分和潛在機制的新策略［24］。本研究采用網絡藥理學方法，進一步探討補骨脂、淫羊藿藥對抗骨質疏松的作用機制。

首先，我們獲取補骨脂-淫羊藿藥對有效成分51種，靶蛋白292 個，經過拓撲分析篩選Degree＞5的有效成分21 種，與26 個靶蛋白相連，其中槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），木犀草素（luteolin），異補骨脂甲素（Isobavachin）和脫水淫羊藿素（anhydroicaritin）處于核心位置。研究表明槲皮素可以通過調節成骨細胞代謝、抑制細胞衰老抵抗骨質疏松的發生［25-27］，木犀草素可以促進成骨細胞的增殖、分化與礦化［28］，關于異補骨脂甲素的研究多集中在神經元細胞的分化［29］，脫水淫羊藿素是新鑒定的轉錄因子SREBP2 的抑制劑，可抑制破骨細胞生成并改善糖尿病引起的骨丟失［30］。這些可以解釋中草藥的多效性。

此外，篩選出補骨脂-淫羊藿藥對與PMOP 共有132 個共同靶標，分析發現這些共同靶標在轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結合和營養水平等GO 條目顯著富集，同時，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥相關途徑、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、內分泌耐藥、PI3KAkt 信號通路可能是補骨脂-淫羊藿藥對治療PMOP的關鍵。研究表明，絕經后雌激素水平降低與骨質疏松癥、動脈粥樣硬化及糖尿病相關［31］，這也符合中醫學對人體生理和病理狀態的整體理解。在人口老齡化進程中，骨質疏松癥和糖尿病的發病率不斷增長，常合并出現［32］。研究表明，AGE-RAGE信號通路在包括糖尿病性骨病在內的糖尿病并發癥中具有重要作用，通過抑制Wnt，PI3K 和ERK 信號傳導抑制成骨細胞增殖［33］。此外，淫羊藿可通過多種方式影響內分泌系統及下丘腦-垂體-性腺/腎上腺軸［34］。體外研究發現，成骨細胞加載適宜的流體剪切應力可調節基質金屬蛋白酶和其特異性抑制因子的動態平衡，維持機體正常的骨形成和吸收［35］。

骨質疏松癥是一種多基因遺傳易感疾病。人類遺傳基因的多態性決定了人體對疾病和藥物的敏感性和反應，以及臨床表現的多樣性。這類似于中醫中“證”的概念，即疾病發展的某個階段的病理特征的總結，這是身體對致病因素起反應的功能狀態。因此，我們推測中醫理論基礎之一就是多基因性。在這項研究中，我們分析了補骨脂-淫羊藿藥對通過多靶點、多途徑治療PMOP 的作用機制，但是，本研究仍然存在一些局限性。首先，我們的有效成分和靶蛋白的收集并不全面。這些可以通過使用液相色譜法、質譜法、二維液相色譜-四極桿飛行時間質譜法等方法來改進。其次，我們的網絡藥理學研究缺乏動物實驗和臨床試驗來驗證這一假設。在以后的研究中，我們將努力進行體內、體外實驗來驗證補骨脂-淫羊藿藥對的作用機制和配伍應用。