不同新冠病毒核酸檢測系統結果一致性的驗證及分析評價

李中秋，季全義

（北京市密云區鼓樓社區衛生服務中心檢驗科，北京 101500）

2020 年1 月20 日國家衛生健康委發布公告，將新型冠狀病毒感染的肺炎納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施[1]。我區疾控在2022 年參加新冠病毒核酸檢測工作期間，嚴格執行《新型冠狀病毒核酸檢測質控與實驗室生物安全管理規范》，確保能及時發現和報告新型冠狀病毒感染的肺炎病例，有效遏制疫情播散和蔓延。其間，世界衛生組織提出的“關切的變異株”有阿爾法、貝塔、伽瑪、德爾塔和奧密克戎。當時奧密克戎株感染病例已取代德爾塔株成為主要流行株[2]，在我國境內常規使用的 PCR 檢測診斷準確性未受到影響，新冠病毒核酸檢測陽性仍為確診的首要標準。隨著我區常態化新冠疫情防控措施的落實落細，檢測標本量的不斷增加，傳統手工實時熒光定量PCR檢測方法已經不能滿足現有檢測需要。高通量的病原體核酸提取檢測系統開始在本實驗室得到應用。本文對兩種新冠病毒核酸檢測系統的檢測能力、結果一致性及生物安全風險進行了驗證和分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從菌毒種庫（-70℃）[3]中隨機選取2022 年10月—2022 年12 月已滅活確認陽性的新冠病毒感染(COVID-19)[4]者鼻咽拭子樣本16 例，陰性樣本4 例。

1.2 儀器與試劑

珀金埃爾默（PerkinElmer）explorer G3 高通量自動化病原體核酸提取檢測系統（配置：Plate::handler Flex750 機 械 手 臂、3 臺Chemagic 360 核 酸 提 取 儀、JANUS G3 自動化液體處理工作站、4titude 自動封膜機、LiCONiC LPX280 儲 板 棧、BioTek MultiFlo 快 速分 液 器、2 臺LightCycler 480 Ⅱ實 時 熒 光 定 量PCR儀）[5]、耐優（NAYO）ES96 全自動樣品處理系統；ABI QuantStudio Dx 實 時 熒 光 定 量PCR 檢 測 儀、Chemagic360 全自動核酸提取儀、北京大龍DM0636離心機、漩渦震蕩儀、手動微量移液槍及吸頭。

碩博源核酸提取純化試劑（Nucleic Acid Extraction and Purification Kit）、明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）。

1.3 檢測方法

本實驗室按要求參加室間質量評價。兩種檢測系統分別設置一個弱陽性對照質控樣本和三個陰性對照質控樣本，對照樣本隨機放在待測樣本中間，同批參與核酸檢測。所有試劑均在有效期內。使用明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒，靶基因為 ORFlab 和N 基因序列，以人類管家基因RNaseP作為內標，以保障檢測結果的特異性與準確性。弱陽性和三個陰性對照樣本的檢測結果均滿足質量控制要求時，方可進行檢測結果的判定。

1.3.1 珀金埃爾默explorer G3 高通量自動化病原體核酸提取檢測系統 通過耐優ES96 全自動樣品處理系統、珀金埃爾默explorer G3 檢測系統及相關試劑耗材，實現自動化核酸提取、PCR 體系構建、自動封膜、在線qPCR 擴增分析。

1.3.2 傳統ABI QuantStudio Dx 實時熒光定量PCR 檢測系統 在樣本準備區生物安全柜內進行樣本提取，使用Chemagic360 核酸提取儀進行提取純化操作。在試劑準備區，取出 N 個（四個陰陽性質控品數+ 待檢樣本數）PCR 反應管，加好反應液。在樣本準備區行加樣封膜瞬時離心后，移至擴增和產物分析區。在ABI QuantStudio Dx 實時熒光定量PCR 檢測儀上設置樣品名稱，選擇熒光檢測通道，設定循環參數后進行核酸檢測。

1.4 檢測結果判定標準

陰性質控要求： ROX 通道擴增曲線無指數增長或Ct ≥35, FAM 與VIC / HEX 通道擴增曲線無指數增長或 Ct ≥40。陽性質控要求： FAM 、 VIC / HEX 、 ROX三個通道擴增曲線均呈指數增長且 Ct ＜35。

1.4.1 陽性陰性判定值 利用 ROC 曲線法確定陽性陰性： FAM 通道擴增曲線呈指數增長且 Ct ＜38 為FAM 陽性；FAM 通道擴增曲線無指數增長或Ct ≥40為 FAM 陰性。 VIC / HEX 通道擴增曲線呈指數增長且 Ct ＜38 為 VIC / HEX 陽性；VIC / HEX 通道擴增曲線無指數增長或Ct ≥40 為 VIC / HEX 陰性。ROX 通道擴增曲線呈指數增長且 Ct ＜35 為 ROX 陽性； ROX 通道擴增曲線無指數增長或 Ct ≥35 為ROX 陰性。

1.4.2 樣品檢測結果判定 陽性樣本判定標準： FAM 、VIC / HEX 和 ROX 三個通道均為陽性，可報告為陽性樣本。陰性樣本判定標準： ROX 通道為陽性， FAM 與VIC / HEX 通道為陰性，可報告為陰性樣本。

1.5 統計學分析

通過醫學統計學中配對定量資料的t檢驗比較兩種系統檢測新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值有無差異。采用Kappa 一致性檢驗對兩種檢測系統陰陽性結果的四格表數據進行分析。

2 結果

兩種系統檢測20 份新冠病毒樣本的靶基因（ORF1ab 和N 基因）原始Ct 值見表1、表2。計算t值為0.446，t0.05/2，19=2.093，|t|＜t0.05/2，19，故P＞0.05，兩種系統檢測新冠病毒樣本的ORF1ab 基因Ct 值差異無統計學意義。計算t值為0.291，t0.05/2，19=2.093，|t| ＜t0.05/2，19，故P＞0.05，兩種系統檢測新冠病毒樣本的N 基因Ct 值差異無統計學意義。

表1 兩種系統檢測ORF1ab 基因原始Ct 值

表2 兩種系統檢測N 基因原始Ct 值

兩種系統檢測20 份新冠病毒樣本，ROX 通道（為內控RNaseP 指示通道）均為陽性，判定結果詳見表3。兩種系統檢測新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值經過“樣品檢測結果判定標準”中陰陽性結果判定后，整理成配對設計的四格表數據，采用Kappa 一致性檢驗進行分析，Kappa 系數=1，兩種系統檢測結果的一致性非常好。

表3 兩種系統檢測新冠病毒樣本陰陽性結果

3 討論

核酸檢測的生物安全、效率、準確性是疫情防控工作中最重要的一環。實時熒光定量PCR 核酸檢測是新冠檢測公認的金標準，本文對兩種實時熒光定量PCR 核酸檢測系統進行對比分析的結果顯示：兩種系統檢測新冠病毒樣本的靶基因（ORF1ab 和N 基因）Ct 值差異無統計學意義，陰陽性判定檢測結果的一致性非常好。ABI QuantStudio Dx 相關檢測系統從核酸提取、試劑配制到PCR 檢測的操作和銜接過程都需要進行大量精細操作，生物安全風險較大，操作空間至少需要三室，耗費大量人力、時間，因此無法滿足日益增加的檢測需求；反觀珀金埃爾默explorer G3相關檢測系統可實現自動化和標準化工作流程和操作步驟，全自動流程減少了檢驗人員與樣本接觸，有效降低了感染風險, 并大幅減少了人力需求；樣本通量高，可全天候運行，迅速提升病毒檢測能力；移液精度高，可減少人為失誤；設備占用空間小，生物安全隱患小。

綜上所述，傳統手工核酸檢測系統在樣本量較少的情況下，可基本滿足實驗室需要，并可用于自動化核酸提取系統檢測結果的復核檢測。自動化核酸提取系統適合大批量檢測，其同樣具有良好的精確度和準確性，有利于進行質量控制和標準化。在新型冠狀病毒大流行結束后，高通量自動化病原體核酸提取相關檢測系統因其為模塊化設計的自動化整合系統，能夠根據疫情需要，迅速調整檢測規模，同時也可用于其他實驗室檢測，可見此系統的廣泛應用是實驗室檢測未來發展的趨勢。