小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41的生物信息學分析

李 會，胡 朗，李 探，王 會*

（1.徐州醫科大學基礎醫學院生物化學教研室，江蘇 徐州 221004；2.江蘇省免疫與代謝重點實驗室，江蘇 徐州 221004）

Bhlhe41 是堿性螺旋- 環- 螺旋（bHLH）蛋白家族成員，是一種轉錄抑制因子，Bhlhe41 通過與Bmal1 蛋白質的相互結合作用或通過對E-box 元素的競爭抑制了Clock/Bmal1 誘導小鼠Per1 啟動子的反式激活，從而調控晝夜節律及睡眠[1]。除此之外，在外周免疫系統中，轉錄抑制因子Bhlhe41 被發現高度表達于B-1 細胞和肺巨噬細胞，調控B-1 細胞的發育及細胞增殖，影響B-1 細胞的發育、增殖和自我更新[2]。本課題組前期利用自主構建的轉錄抑制因子Bhlhe41 熒光示蹤和敲除小鼠Bhlhe41dTomato-Cre/+，首次鑒定發現Bhlhe41 示蹤新的過渡性B-1 細胞祖細胞亞群，并發現中樞神經系統中Bhlhe41 表達于小膠質細胞中[3]。再者，Bhlhe41 在多種腫瘤細胞中發揮作用，如大腸癌、肺癌等[4-5]。近期也有研究報道，Bhlhe41在中樞神經系統膠質母細胞瘤中的增殖中也具有重要的作用，可成為膠質母細胞瘤治療的靶點分子[6]。作為轉錄抑制因子，Bhlhe41 可調控中樞神經系統中的晝夜節律以及B1 細胞和肺巨噬細胞的生命活動。除此之外，Bhlhe41 也參與調控膠質母細胞瘤的發生發展，但Bhlhe41 的結構基礎和具體作用機制目前尚不清楚。研究小鼠Bhlhe41 的蛋白性質和結構對研究Bhlhe41 的功能具有重要的意義，目前尚未見Bhlhe41蛋白結構分析的相關報道。本研究利用生物信息學工具對小鼠Bhlhe41 的蛋白性質和結構進行預測和分析，旨在為研究轉錄抑制因子Bhlhe41 在生理和病理條件下的功能及調控機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 獲取小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 的氨基酸序列。

1.2 方法

利用生物信息學分析軟件ExPASy 分析Bhlhe41蛋白的理化性質和疏水性（https://web.expasy.org/protparam），SOPMA 分析Bhlhe41 的二級結構（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），SMART 分 析Bhlhe41 的 結 構 域 特 征（http://smart.embl-heidelberg.de/），Swiss Model 分析Bhlhe41 的三級結構（https://swissmodel.expasy.org/），String 分析Bhlhe41 的相互作用蛋白（https://cn.string-db.org/cgi/download?sessionId=bDYDvh98tw RA）。

2 結果

2.1 Bhlhe41 的理化性質

小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 的分子式為C1955H3104N558O575S10， 含410 個 氨 基 酸 殘 基， 由20種基本氨基酸組成。Bhlhe41 蛋白質分子量為43 946.15，等電點為8.07，含有帶正電荷的氨基酸殘基（賴氨酸+ 精氨酸）45 個，含有帶負電荷的氨基酸殘基（谷氨酸+ 天冬氨酸）43 個。Bhlhe41 蛋白的不穩定指數為53.55，根據蛋白質穩定參數在40 以下判定為穩定蛋白質，推測小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 屬于不穩定蛋白質。Bhlhe41 的脂溶系數為82.07，親水系數為-0.361，說明該蛋白為親水性蛋白質。利用ProtScale 軟件分析Bhlhe41 的親/ 疏水性，結果顯示大多數氨基酸分值為較低的負值，表明Bhlhe41 是親水性較強的蛋白質（見圖1）。

圖1 小鼠Bhlhe41 疏水性分析

2.2 Bhlhe41 二級結構分析

利用SOPMA 分析小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 的二級結構，窗口參數（Window width）設置為17，相似閾值（Similarity threshold）設置為8，狀態數（Number of states）設置為4。結果如圖2 所示。分析結果顯示，二級結構中含有38.54% 的α- 螺旋（158 個氨基酸殘基），6.59% 的延伸鏈（27 個氨基酸殘基），51.22%的無規卷曲（210 個氨基酸殘基），3.66%的β-轉角（15 個氨基酸殘基）。

圖2 小鼠Bhlhe41 二級結構分析

2.3 Bhlhe41 結構域和三級結構分析

利用SMART 軟件對小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41的功能結構域進行分析，結果顯示該轉錄抑制因子含有一個HLH 結構域和一個ORANGE 結構域（見圖3A）。利用Swiss Model 軟件預測Bhlhe41 三級結構，以Bhlhe41 為模板（O35779.1.A）進行同源建模，預測結果如圖3B 所示，GMQE 值為0.58，GMQE 值在0 ～1 之間，越接近1則建模質量越好，表明預測結構可靠。

圖3 小鼠Bhlhe41 結構域和三級結構分析

2.4 Bhlhe41 相互作用蛋白分析

利用String 在線數據庫預測小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 的相互作用蛋白，若關聯系數＞0.4，表明蛋白相互作用顯著。String 數據庫分析結果顯示與Bhlhe41 構建成為核心相互作用網絡的10 個分子分別是GSK3β、Clock、Cry1、Cry2、Csnk1e、Bhlhe40、Arnt1、Per2、Nr1d1、Npas2。見圖4。

圖4 Bhlhe41 相互作用蛋白網絡圖

3 討論

轉錄抑制因子Bhlhe41 除了參與晝夜節律的調控外，近年來研究發現其也參與調控外周B1 細胞和肺巨噬細胞的生命活動以及中樞神經系統中膠質母細胞瘤的發生發展，可能成為膠質母細胞瘤治療的靶點分子。本文通過生物信息學分析軟件分析發現Bhlhe41 是一種不穩定的親水性堿性蛋白質，含有一個HLH 結構域和一個ORANGE 結構域，與其構建成核心相互作用網絡的蛋白主要包括調控晝夜節律的基因GSK3β、Clock、Cry1、Cry2 等。蛋白質結構是其功能的基礎，本文通過深入分析Bhlhe41 的理化性質和蛋白質結構，為深入研究Bhlhe41 在生理和病理條件下的功能及調控機制奠定了實驗基礎。本研究中，蛋白質理化性質預測結果表明小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 是一個不穩定的親水性堿性蛋白質，此結果可為后續Bhlhe41 蛋白的提純、鑒定和純化奠定實驗基礎。轉錄因子bHLH 家族中與DNA 結合的結構域為HLH 結構域N 端的堿性區域（由10 ～20 個氨基酸組成），HLH 區域則主要負責蛋白與蛋白間的相互作用，形成同型或異型二聚體。與bHLH 家族的蛋白結構一致，我們的預測結果中也顯示Bhlhe41 的N 端含有一個HLH 結構域，但是，目前鮮有報道Bhlhe41中HLH 結構域的功能，還需深入探討。轉錄因子可以與其他蛋白質相互作用，從而調節基因的表達。本研究通過String 數據庫預測發現Bhlhe41 構建成為核心相互作用網絡的分子主要包括調控晝夜節律的基因Clock、Cry1、Cry2、Bhlhe40、Csnk1e、Arnt1、Per2、Nr1d1、Npas2。此外，Bhlhe41 可能也與絲氨酸/ 蘇氨酸激酶GSK3β 相互作用。晝夜節律基因參與多種生命活動，如調節內質網應激、細胞凋亡、細胞自噬等，再者，晝夜節律基因也與腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病等密切相關[7-9]。因此，Bhlhe41 相互作用蛋白的預測可為進一步研究其在不同生理狀態下和不同病理狀態下的信號轉導機制提供一定的依據。

綜上所述，小鼠轉錄抑制因子Bhlhe41 調控多種生命活動，通過生物信息學方法分析其蛋白的性質和結構特征及其相互作用蛋白，可為研究Bhlhe41 在不同生理和病理條件下的作用與功能提供必要的信息，也可為Bhlhe1 參與的相關疾病研究和治療提供新的分子靶點和干預策略。