健脾法防治運(yùn)動性疲勞思路探討及其改善線粒體功能的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究

彭娟， 田佳慶， 韋華妮， 潘華山，3，4， 荊純祥

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)體育健康學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510378；3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520；4.廣東潮州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，廣東潮州 521000）

運(yùn)動性疲勞屬于運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重點(diǎn)研究方向。國際田徑聯(lián)合會將運(yùn)動性疲勞定義為機(jī)體在運(yùn)動后，肌肉能力暫時降低，不能維持原有的運(yùn)動強(qiáng)度的現(xiàn)象[1]。當(dāng)運(yùn)動性疲勞未及時恢復(fù)或調(diào)整，將變成一種病理現(xiàn)象，對健康可造成不良影響。延緩運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生以及如何加速消除運(yùn)動后的疲勞，是近半個世紀(jì)以來運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)及熱點(diǎn)課題[2]。本研究通過分析運(yùn)動性疲勞的中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制，提出健脾防治運(yùn)動性疲勞的思路，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以健脾代表方補(bǔ)中益氣湯為例探討健脾法防治運(yùn)動性疲勞的可能作用機(jī)制。

1 健脾以干預(yù)運(yùn)動性疲勞

1.1 脾虛為運(yùn)動性疲勞的核心病機(jī)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)運(yùn)動性疲勞的發(fā)病機(jī)制尚未統(tǒng)一，目前比較公認(rèn)的是“衰竭學(xué)說”和“堵塞學(xué)說”?！八ソ邔W(xué)說”認(rèn)為，運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生的主要原因是運(yùn)動過程中體內(nèi)三磷酸腺苷-磷酸肌酸（ATP-CP）等高能磷酸物大量消耗而得不到及時補(bǔ)充。線粒體作為有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所，可為生物組織和細(xì)胞提供進(jìn)行生命活動所需的能量或ATP。當(dāng)骨骼肌線粒體受損時，將不能繼續(xù)為肌纖維收縮提供能量?！岸氯麑W(xué)說”認(rèn)為，運(yùn)動性疲勞主要是因?yàn)槟承┰隗w內(nèi)大量堆積的代謝產(chǎn)物不能及時被消除，影響了體內(nèi)正常代謝，從而造成運(yùn)動能力下降。當(dāng)骨骼肌線粒體受損時，將不再進(jìn)行有氧呼吸，進(jìn)而轉(zhuǎn)為無氧呼吸，致使大量的代謝產(chǎn)物如乳酸在體內(nèi)堆積。上述兩種運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生機(jī)制的假說雖從不同角度提出，但均與線粒體有關(guān)，即線粒體損傷會影響骨骼肌的代謝，誘導(dǎo)乳酸堆積，導(dǎo)致運(yùn)動性疲勞。

中醫(yī)認(rèn)為，勞動或運(yùn)動（勞力、勞役、強(qiáng)力舉重、持重遠(yuǎn)行、疾走、涉水等）均可稱之為“勞”。《素問·舉痛論》曰：“勞則喘息汗出，內(nèi)外皆越，故氣耗也”，指出過勞易致氣耗，漸則演變?yōu)闅馓摗！毒霸廊珪吩疲骸皠诰氩活櫿撸喑蓜趽p”，言明疲勞易引起人體損傷。競技運(yùn)動作為一種比勞動強(qiáng)度更大的劇烈活動，可消耗人體大量氣、血，引起人體的損傷。脾作為后天之本，氣血之源，最易受損。古代文獻(xiàn)中記載的“疾使四肢則脾傷汗泄”“行役勞倦積久敗脾”等，均指出過勞易傷及脾臟。提示運(yùn)動性疲勞不加以防治，將損傷人體氣血、損傷脾臟，最終發(fā)展成脾虛、氣虛等?！鹅`樞·本神》記載：“脾氣虛則四肢不用，五臟不安”，指出若脾氣虛，則四肢功能障礙，五臟失于調(diào)和。已有研究表明，運(yùn)動性疲勞脾虛證普遍存在，而運(yùn)動性疲勞脾虛各證中又以脾氣虛證最為常見[3]。

綜上，脾虛既是運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵病機(jī)，也是導(dǎo)致運(yùn)動性疲勞程度加重的主要因素；線粒體功能障礙在運(yùn)動性疲勞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.2 健脾法防治運(yùn)動性疲勞綜合以上運(yùn)動性疲勞的中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制可知，運(yùn)動性疲勞主要涉及中醫(yī)的脾和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的線粒體。已有學(xué)者探討了中醫(yī)脾與線粒體二者之間的相關(guān)性[4-5]，認(rèn)為中醫(yī)脾的生理功能與線粒體的功能特點(diǎn)存在多方面的共通之處：脾主運(yùn)化的功能與線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能過程相吻合；在電鏡下發(fā)現(xiàn)骨骼肌線粒體數(shù)目眾多，且多沿著肌纖維整齊排列，肌肉正是依靠這些線粒體的能量代謝功能而發(fā)生收縮，若肌肉組織中的線粒體數(shù)目過少或是形態(tài)功能發(fā)生異常，則無法產(chǎn)生足夠的ATP（其功用類似中醫(yī)的“氣”）來維持肌肉的收縮需求，最終會導(dǎo)致四肢的無力痿廢。運(yùn)動過程中物質(zhì)消耗的補(bǔ)充依賴于脾胃運(yùn)化以源源不斷地產(chǎn)生營衛(wèi)之氣，從而促進(jìn)運(yùn)動性疲勞的修復(fù)。脾胃功能正常，氣血生化有源，可為預(yù)防運(yùn)動性疲勞提供保障。因此，采用健脾法可防治運(yùn)動性疲勞，且其健脾機(jī)制可能與改善線粒體功能有關(guān)。

2 以補(bǔ)中益氣湯為例探討健脾法改善線粒體功能防治運(yùn)動性疲勞的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制

近年來，已有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)脾虛與線粒體的結(jié)構(gòu)與功能異常之間存在一定相關(guān)性。彭艷等[6-7]的研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證的病理機(jī)制主要為線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變；脾虛模型大鼠出現(xiàn)ATP生成障礙，說明脾虛可以導(dǎo)致線粒體功能下降。劉文俊等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，脾虛大鼠的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體嵴減少、空泡化的結(jié)構(gòu)損傷，同時伴有ATP 含量減少。屈小虎等[9]發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌線粒體能量代謝存在多方面的變化，其ATP 含量、線粒體復(fù)合物活性、檸檬酸合酶（CS）活性、線粒體DNA 拷貝數(shù)、COXⅣ蛋白及其mRNA表達(dá)量均降低，細(xì)胞色素C（Cyt-C）蛋白及其mRNA 表達(dá)量均升高。由此可見，脾虛證運(yùn)動性疲勞的發(fā)生機(jī)制及其診治的思路可能與線粒體功能密切相關(guān)。

現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，健脾中藥的有效成分可通過調(diào)控線粒體功能來改善運(yùn)動性疲勞。如黃燕峰等[10]指出，黃芪多糖可提高動物運(yùn)動時的耐力及肌力，且其改善線粒體功能障礙的作用是通過降低機(jī)體組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平、改善骨骼肌細(xì)胞線粒體自噬、刺激線粒體起源發(fā)生和維持線粒體融合－分裂平衡來完成的。楊佳丹等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，在模擬高原環(huán)境下，人參皂苷Rg3可改善疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)，提高骨骼肌線粒體對自由基的消除作用和供能效力，從而延長大鼠力竭游泳的時間。楊芳芳[12]指出，紅景天苷可緩解大鼠運(yùn)動性疲勞的發(fā)生，通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，從而提升抗氧化系統(tǒng)的防御能力，強(qiáng)化線粒體的呼吸功能。Ya H 等[13]指出，大花紅景天的抗疲勞作用可能與通過調(diào)節(jié)PINK1/Parkin信號通路抑制線粒體吞噬有關(guān)。林致輝[14]指出，小建中湯可以提高小鼠的抗疲勞能力，其機(jī)制與改善線粒體功能、保持骨骼肌細(xì)胞膜完整性、防止脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生等有關(guān)。以上研究表明，中醫(yī)健脾法不僅對防治運(yùn)動性疲勞具有明顯的療效，且提示健脾與改善細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系密切。

補(bǔ)中益氣湯為健脾法的代表方，具有健脾益氣、升陽舉陷的作用。以下采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以補(bǔ)中益氣湯為例，基于健脾、線粒體功能與運(yùn)動性疲勞的相互關(guān)系探討健脾法防治運(yùn)動性疲勞的作用機(jī)制。

2.1 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法

2.1.1 補(bǔ)中益氣湯活性成分作用靶點(diǎn)分析 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），檢索補(bǔ)中益氣湯主要組成藥物（黃芪、白術(shù)、陳皮、人參、升麻、柴胡、當(dāng)歸）的化學(xué)成分?？紤]炙甘草在此方中主要起調(diào)和諸藥的作用，且炙甘草活性成分較多，為避免對補(bǔ)中益氣湯主要成分的影響，故未對炙甘草進(jìn)行檢索整理。對檢索得到的活性成分進(jìn)行匯總、整理后，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得各個藥物化學(xué)成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性指數(shù)（drug-like index，DL），選取OB ≥30%且DL ≥0.18的化學(xué)成分作為有效活性成分。篩選出活性成分較高的化合物并收集其靶蛋白。去除重復(fù)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）對上述靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范和矯正，物種選擇為“人類”，用靶蛋白的簡寫表示，并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因靶點(diǎn)名稱（gene symbol），構(gòu)建并完善藥物活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

2.1.2 疾病基因靶點(diǎn)庫的建立 檢索運(yùn)動性疲勞的疾病靶點(diǎn)，以“exercise-induced fatigue”“sports fatigue”和“sport fatigue”為檢索詞，分別在數(shù)據(jù)庫OMIM（https://www.omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/） 以 及 Drugbank （https://go.drugbank.com/）中進(jìn)行檢索，去除重復(fù)值后，獲得運(yùn)動性疲勞的疾病基因靶點(diǎn)。

2. 1. 3 共有靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步探究補(bǔ)中益氣湯活性成分的作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將中藥活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相互映射，并對二者的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得共同靶點(diǎn)交集。將得到的藥物-疾病潛在作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入String 數(shù)據(jù)庫（http://string-bd.org）中，物種選擇為“homo sapiens”即“人類”，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，去除無相互作用關(guān)系的靶點(diǎn)，輸出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并統(tǒng)計(jì)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2. 1. 4 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)上傳至Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。限定物種為“人類”，選擇“自定義分析（custom analysis）”，分別進(jìn)行KEGG 通路分析。KEGG 通路分析設(shè)定，P＜0.01，以確定交集靶點(diǎn)富集通路，進(jìn)一步去除其他疾病信號通路，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)富集較多的通路作為關(guān)鍵通路。

2.2 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的活性成分及作用靶點(diǎn) 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇可能是補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的主要活性成分（如圖1所示）。槲皮素是常見的黃酮類物質(zhì)，研究[15]表明，槲皮素具有良好的抗疲勞效果；補(bǔ)充槲皮素能影響機(jī)體在運(yùn)動過程中體內(nèi)供能物質(zhì)的變化，通過減少蛋白質(zhì)消耗及增加脂肪消耗來提高運(yùn)動耐力。在脂肪消耗增多的情況下，槲皮素可通過提高運(yùn)動訓(xùn)練大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平來增強(qiáng)自由基的清除效率，從而減少因脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基對機(jī)體的損傷，也可對線粒體起到保護(hù)作用[16]。除此之外，槲皮素還可通過改善線粒體生成來增強(qiáng)運(yùn)動耐力[17]。豆甾醇和β-谷甾醇均為植物甾醇類成分，目前主要用于控制血脂[18]。Bouic P J 等[19]通過研究β-谷甾醇膠囊對南非馬拉松志愿者的影響，發(fā)現(xiàn)受試者服用β-谷甾醇后，其賽后體內(nèi)的白細(xì)胞介素6（LI-6）、皮質(zhì)醇的上升幅度得到控制，由此可緩解因馬拉松比賽引起的局部炎癥反應(yīng)，降低受試者的疲勞感；研究也提示存在有通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮防治運(yùn)動性疲勞的可能。

圖1 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的活性成分及作用靶點(diǎn)Figure 1 The active components and their acting targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.2 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò) 大腦是疲勞感知的中樞調(diào)節(jié)器，而促炎性細(xì)胞因子是大腦感知疲勞的重要介質(zhì)[20-21]。補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示。 由圖2 可知，補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等。而IL-6、IL-1β 以及TNF家族中的TNF-α 是最重要的促炎性細(xì)胞因子。TNF-α是運(yùn)動過程中最早產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-1β 的產(chǎn)生[22]。動物實(shí)驗(yàn)研究[22-23]已表明，高強(qiáng)度訓(xùn)練可影響機(jī)體內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子的水平，而電針治療可改善此類促炎性細(xì)胞因子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-羥色胺和多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)的影響，從而消除運(yùn)動性疲勞。除此之外，IL-1β 還可通過調(diào)節(jié)大腦海馬神經(jīng)元的功能[24]和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制以調(diào)控運(yùn)動性疲勞[25]。

圖2 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The protein-protein interaction（PPI）network of the key targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.3 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞的KEGG 信號通路 KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞可能涉及甲狀腺激素信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）信號通路等多種通路，結(jié)果見圖3。甲狀腺激素作為氨基酸衍生物，可促進(jìn)機(jī)體新陳代謝和發(fā)育，提高神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。若運(yùn)動過量時，甲狀腺功能發(fā)生紊亂，可影響機(jī)體正常的能量物質(zhì)代謝，進(jìn)而影響運(yùn)動耐力[26]；同時，甲狀腺激素可直接作用于心肌細(xì)胞，促進(jìn)鈣離子的釋放，可使心臟搏動加快，心臟收縮力增強(qiáng)[27-28]，確保運(yùn)動的正常進(jìn)行。5-羥色胺作為神經(jīng)遞質(zhì)時是一種自體活性物質(zhì)，機(jī)體受到刺激時，5-羥色胺負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)人體生理變化。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)5-羥色胺含量的提高可刺激小鼠大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)大腦皮質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，從而減少疲勞感的產(chǎn)生[23]。HIF 信號通路與骨骼肌細(xì)胞的營養(yǎng)供給及氧代謝存在著密切的聯(lián)系，HIF-1α 的表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)骨骼肌的營養(yǎng)供應(yīng)，促進(jìn)疲勞的消除[29]。

圖3 補(bǔ)中益氣湯防治運(yùn)動性疲勞靶點(diǎn)的KEGG信號通路富集分析Figure 3 The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）signal pathway enrichment analysis of the targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

3 小結(jié)

運(yùn)動性疲勞在一定程度上可影響體育運(yùn)動者的競技水平，任其發(fā)展會對人體健康造成不良影響。本文基于文獻(xiàn)分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方法，提出了健脾防治運(yùn)動性疲勞的思路，并以補(bǔ)中益氣湯為例探討了健脾防治運(yùn)動性疲勞的可能機(jī)制。分析結(jié)果顯示，脾虛是運(yùn)動性疲勞的重要病機(jī)，線粒體功能障礙在運(yùn)動性疲勞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。中醫(yī)健脾法對防治運(yùn)動性疲勞具有明顯優(yōu)勢，而調(diào)節(jié)線粒體功能可能成為中醫(yī)防治運(yùn)動性疲勞的療效機(jī)制研究的切入點(diǎn)。今后有關(guān)運(yùn)動性疲勞防治的研究，應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)的傳統(tǒng)優(yōu)勢，有機(jī)整合分子生物學(xué)，進(jìn)一步深化對健脾法防治運(yùn)動性疲勞潛在機(jī)制的認(rèn)識，深入挖掘與調(diào)控線粒體功能有關(guān)的新的治療靶點(diǎn)，為健脾法防治運(yùn)動性疲勞提供依據(jù)。