基于HS-SPME-GC-MS建立廣陳皮陳化年份快速判別模型

石洪超， 陳明權， 商雪瑩， 李華， 孫東， 覃仁安， 何風雷

（1.廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東廣州 510288；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510663）

廣陳皮為經典的藥食同源產品，其中來源于茶枝柑，Citrus reticulata‘Chachi’的果皮稱為“廣陳皮”，為道地藥材，主產于兩廣地區。傳統中醫藥理論及歷代本草論述中均認為廣陳皮“陳久者良”，是指廣陳皮需放置陳化后才能作為藥用，且陳化時間越久，藥效越好[1]。在廣陳皮的市場流通過程中，陳化年份對廣陳皮的價格也具有決定性的影響，從而產生了“一兩陳皮一兩金，百年陳皮勝黃金”的說法。但對于廣陳皮年份的判定，并沒有相關的統一標準及規定，基本靠陳皮銷售者自律和采購者的經驗鑒別，為維護陳皮市場健康穩定的發展，建立廣陳皮年份準確、快速的判定方法在陳皮市場行業中尤為重要。

廣陳皮在陳化過程中會出現外觀顏色差異與氣味差異，也是經驗判別廣陳皮陳化年份的重要參考。外觀顏色易受到干燥方式、儲存條件、加工炮制方法等因素的影響而發生改變[2-3]，而氣味差異預示著不同陳化年份廣陳皮中的揮發油成分處于動態變化之中。相對而言，內在的成分指標更為穩定，因此，從揮發油成分的角度探索廣陳皮隨陳化年份的變化規律是可行的、合理的。目前，針對不同陳化年份廣陳皮的揮發油變化已有諸多研究[4-5]，但對于揮發油成分變化趨勢及與年份間的內在規律未能闡述清楚，難以準確地鑒別廣陳皮年份。因此，本研究以自然陳化的廣陳皮為研究對象，探尋揮發油成分與陳化年份之間的規律，以期建立一種廣陳皮陳化年份的鑒別模型，既可真實、客觀地反映不同年份廣陳皮之間氣味差異的成分變化，又可快速、準確地鑒別出廣陳皮的陳化年份，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 試驗樣品為保證用于建立模型的樣品陳化年份的可靠性，本試驗樣品直接從在廣陳皮道地產區且建立廣陳皮規范化產業化種植基地的公司購買，其中編號為CP1 ～CP6 購自江門市新會區柑滿園食品有限公司（種植基地位置為22°23’25”N、113°7’20”E），CP7 ～CP10 購自江門市蓬江區高品農業發展有限公司（種植基地位置為22°19’59”N、113°6’42”E）。本研究所用樣品均由廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑，Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，樣品詳細信息見表1。

表1 廣陳皮樣品信息表Table 1 Sample information sheet of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

1. 2 儀器7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；75 μm PDMS/DVB 固相微萃取儀-纖維頭（美國SUPELCO 公司，灰色）；BS110S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；WXJ 型粉碎機（上海凱旋中藥機械制造有限公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品制備將廣陳皮樣品剪碎成邊長1 cm的小方塊，取1.0 g 于250 mL 頂空瓶中，密封后于90 ℃水浴平衡10 min，插入固相萃取纖維50/30 μm CAR/DVB/PDMS頂空萃取40 min，250 ℃解吸3 min進樣。

2.2 測定條件色譜條件：采用安捷倫HP-5 MS（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）色譜柱，高純He 作為載氣，流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為230 ℃，采用程序升溫模式，柱初始溫度為50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升至70 ℃，保持10 min；以8 ℃/min的速率升至110 ℃，保持5 min；以4 ℃/min的速率升至210 ℃，保持2 min。分流比為30∶1。質譜（MS）條件：離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，離子采集范圍35 ～450，m/，z。廣陳皮樣品GC/MS色譜圖，見圖1。

2.3 揮發油測定結果所得質譜數據與NIST14數據庫進行匹配后，將每組數據進行整理，選擇其中每個峰的高匹配成分（定性匹配度＞80）。10 組（8個不同陳化年份）廣陳皮共匹配出75個揮發油成分，其中共同含有的揮發性成分有17 個，編號為S1 ～S17，見表2。各成分在不同陳化年份的廣陳皮中相對含量存在明顯差異，且與陳化年份呈現上升、下降或先上升再下降等多種變化趨勢。

表2 不同陳化年份的廣陳皮中共有揮發性成分Table 2 Total volatile components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years

2. 4 揮發油成分隨儲存廣陳皮年份變化規律分析為探尋共有成分與不同陳化年份之間的相關性，采用SPSS 19.0 軟件對17 個共有成分分別與陳化年份進行Pearson 相關性分析，其中有8 個成分與陳化年份具有一定的相關性，見表3。成分S9、S16、S17 與年份具有非常顯著相關性（P＜0.01），S6、S7、S8 與陳化年份具有顯著相關性（P≤0.05），成分S4、S15 雖然與年份的相關性不顯著（P＞0.05），但考慮到其Pearson 相關系數絕對值均大于0.7，也認為成分S4、S15 與陳化年份之間具有一定的相關性。由表2 可看出：成分S4、S6、S7、S8、S15 整體上呈現出隨著陳化年份增加，其相對含量逐漸減少的趨勢；而成分S9、S16、S17 則呈現隨著陳化年份增加，其相對含量也逐漸增加的趨勢。因此，擬將上述8個共有成分納入與年份變化規律的研究范疇。

表3 不同陳化年份廣陳皮中的8個共有成分與陳化年份之間的相關性分析結果Table 3 Correlation analysis results between 8 common components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years and aging years

將與年份呈負相關的成分（S4、S6、S7、S8、S15）分別排列組合作為分子組，與年份呈正相關的成分（S9、S16、S17）分別排列組合作為分母組，將每個分子組分（FZ）和分母組分（FM）分別進行比較，為顧及成分組合的完整性和包容性，分子組與分母組均盡量包含2個及以上的成分，并結合篩選條件（①優選分子與分母中含數量較多的成分，②成分與年份的相關性，P＜0.01 或其相對含量＞0.05%），篩選出與年份呈連續下降或上升趨勢的比值，見表4。最終選定“S9+S16”成分組合作為分母，“S4+S6+S7+S8”與“S4+S6+S7+S8+S15”成分組合作為分子，2 組比值均與年份呈連續下降的趨勢，結果見表5。

表4 廣陳皮中與年份呈連續變化趨勢的組合匯總Table 4 Summary of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表5 廣陳皮中與年份呈連續變化趨勢的組合比值Table 5 Ratio of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

2.5 建立陳化年份判別模型以陳化年份作為自變量（X），以2 組比值分別作為因變量（Y），采用SPSS 19.0 軟件對上述2 組比值分別采用11 種模型進行曲線模擬，上述2組比值分別作為因變量在進行曲線模擬后，發現比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）的各模型方程在整體上相關系數R2 高，說明本成分組比值可以更好地反映陳化年份變化規律的真實情況，結果見表6。

表6 2組比值因變量的模型相關系數Table 6 Model correlation coefficients for 2 sets of ratio dependent variables

陳化年份作為自變量（X），以比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）分別作為因變量（Y），進行曲線模擬，在所有的曲線模擬模型中，優先選擇模型相關系數（R2）最高的曲線；由表7、表8 可知，“復合”“增長”“指數”以及“Logistic”模型相關系數最高且一致（R2= 0.949），且4 種模型相應的模擬曲線圖完全一致，見圖2。因此，4 個方程表達式實為同一函數，綜合考慮到上述4 種方程在實際應用中的運算復雜性，最終選擇復合方程，Y= 613.555×0.893，X（R2=0.949）作為判別不同陳化年份的廣陳皮的模型。

圖2 4種廣陳皮陳化年份判別模型方程擬合曲線圖Figure 2 Fitting curves of the model equations for determining the ageing years of 4 types of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表7 廣陳皮陳化年份判別模型匯總和參數估計值Table 7 Summary and parameter estimates of the model for determining the ageing year of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表8 4種廣陳皮陳化年份判別模型方程表達式Table 8 Expression of the model equation for determining the ageing year of 4 kinds of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

3 討論

對于自然陳化的廣陳皮，可以通過人體嗅覺發現3、10、20、30年等年份跨度較大的廣陳皮氣味依次為果香味、清香撲鼻、陳香醇厚及藥香陳味，這意味著不同年份廣陳皮在陳化過程中出現動態變化的揮發油成分涉及多個成分（4 個及以上），而非單一成分。

現代研究表明，廣陳皮揮發油變化規律較為復雜，隨著陳化年份的增加，揮發油的總量變化有不同的研究結論[6-7]，歸結于影響陳皮揮發油的因素有很多，包括廣陳皮自身采摘期、儲存條件以及揮發油的提取方式等。因此，在探索不同陳化年份的廣陳皮揮發油變化規律過程中，試驗樣品的選擇及揮發油的提取方式尤為重要。

關于試驗樣品的選擇方面，根據地方標準《DB4407/T70-2021 地理標志產品新會陳皮》中規定的“廣陳皮”需在自然陳化環境下保存時間3年或以上[8]。另有研究顯示，陳化年份大于5 年的廣陳皮具有特定波段的吸收[9]，且揮發性成分的含量趨于穩定[10]。因此，本研究以自然陳化5 年以上的廣陳皮為研究對象，探尋其揮發油成分與陳化年份之間的規律。在揮發油提取方式的選擇上，本研究采用SPME 技術提取陳皮樣品中揮發油成分，與傳統的揮發油提取技術不同的是，SPME 技術既不會破壞陳皮樣品又能使揮發油成分被充分提取，節省提取時間，操作便捷，符合快速檢驗的目的。

本研究對參與模型擬定的揮發油成分，不僅要求成分與年份具有一定的相關性，而且為了能綜合全面地反映揮發性成分的動態變化，分子與分母成分組中包含的揮發油成分數量均在2個及以上，且規定各組合的相對含量以及各組合之間產生的比值均與年份呈連續下降或上升的趨勢，相較于其他研究[11]中單一的分子與分母的組合，本法更能真實地反映出揮發油與年份的變化規律。最后進行函數擬合所得到的模型相關系數，R2為0.949，表明本法擬合的方程模型判別廣陳皮年份的準確率更高。以本擬合函數作為廣陳皮陳化年份的判別模型是可行的、準確的。但本年份判別模型是否適用于陳化5 年以下、33 年以上的廣陳皮，尚有待于相應陳化年份的陳皮樣品作進一步驗證。