基于Fast-Tracc方式建立苦瓜高效遺傳轉化體系的研究

劉之洋，劉 靜，寧 宇，戚仁潔，徐 海，陳龍正

（1. 江蘇省農業科學院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點研究室，南京 210014;2. 江蘇海洋大學 藥學院，江蘇 連云港，222005）

遺傳轉化技術在作物性狀改良上發揮了重要作用，改良的優異性狀包括產量、品質、生物和非生物脅迫抗性等方面。其中，基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術因具有操作簡便、編輯效率高、支持多靶點編輯、編輯形式多樣等優勢，成為作物遺傳改良的新興技術，已在許多作物性狀改良上發揮了重要作用[1-5]，但是該方法嚴重依賴于作物的再生和轉化體系[6]。對于遺傳轉化體系較為成熟的作物，如小麥（Triticum aestivum）[7]、水稻（Oryza sativa）[8]、番茄（Solanum lycopersicum）[9]等，基因編輯技術應用相對容易實現。然而，對于大多數蔬菜作物而言，遺傳轉化體系并不成熟，這也成為限制CRISPR/Cas9基因編輯技術在蔬菜作物上應用的關鍵瓶頸問題。因此，建立高效的遺傳轉化體系是實現蔬菜基因編輯的關鍵環節，亟待實現技術突破。大多數蔬菜作物離體培養時，從外植體中誘導分化形成再生芽過程非常困難，受基因型、外植體狀態、培養基類型、生長調節劑類型及含量、培養環境等諸多因素影響[10]。植物分生組織的再生是由幾個主要的發育調節因子（Developmental Regulators，DRs），如WUS（WUSCHEL）、STM（SHOOT MERISTEMLESS）、MP（MONOPTEROS）和GROWTH-REGULATING FACTORs（GRFs）決定的，通過在體細胞中特定表達DRs可直接誘導分生組織再生[11-14]。有研究表明，利用AtGRF5可以將西瓜（Citrullus lanatus）的轉化效率提高到25%左右，與傳統載體相比效率增加了40倍[15]。 除離體培養利用DR提高遺傳轉化效率外，還可以直接在植株上與含有DR的農桿菌進行共培養直接再生，從而實現遺傳轉化，被稱為Fast-Tracc（fast-treated agrobacterium coculture）。該方法的優點一方面體現在不用通過優化外源激素配方來誘導再生芽的生成，避免了從愈傷組織經脫分化、再分化形成再生芽的階段，為解決遺傳轉化頑拗型蔬菜作物的轉基因或者基因編輯技術難題提供了新思路。另一方面，該方法不需要經過組織培養就可獲得轉基因植株，與組培方法相比，用時可縮短2～3個月，大大提高了工作效率。已有研究表明，利用Fast-Tracc方法在煙草（Nicotiana tabacum）上的轉化效率為6%～10%[16]，金魚草（Antirrhinum majus）上轉化效率為3.8%～8.8%，番茄上轉化效率為3.3%～13.3%[17]。苦瓜（Momordicacharantia）屬于遺傳轉化頑拗型蔬菜，遺傳轉化非常困難，目前還未發現利用Fast-Tracc方法的苦瓜遺傳轉化成功的相關報道。本研究利用含有不同DR基因的雙元載體，以農桿菌GV3101為介導，直接侵染不同基因型苦瓜幼苗下胚軸，誘導切口直接再生成芽，獲得轉基因陽性植株。本研究結果能為后續利用非組培方式對遺傳轉化頑拗型蔬菜作物進行基因編輯提供新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 供試的苦瓜材料（品種）為‘K122’（白皮，雌性弱，長勢強旺，分枝多）和‘K103’（白皮，強雌性，長勢弱，分枝少）為本課題組保存的高代自交系。載體pW502和pW503由北京大學現代農業研究院張華偉研究員惠贈，其中，pW502 含有的DR類型為AtGRF5, pW503 含有的DR類型為TaGRF4-OsGIF1[15]，并含有紅色熒光基因（DsRed）作為標記基因。GV3101菌株購自南京諾維贊生物公司。

1.2 苦瓜苗的準備 將苦瓜種子浸種8 h后，置于28 ℃下催芽，選取發芽整齊一致的種子播種于50孔穴盤內，放置于溫室（晝溫28 ℃/夜溫18℃；光周期：光照16 h/黑暗8 h） 中培養。待幼苗長至兩葉一心期，進行實驗。每次接種幼苗數為50株，重復3次。

1.3 農桿菌懸浮液的制備 將含有pW502或pW503的GV3101菌株接入5 mL LB液體培養基（含50 μg·mL-1的Kan，20 μg·mL-1的 Rif抗生素）中振蕩培養（28 ℃，200 r·min-1）, 過夜培養后按照1%的比例轉接菌液至50 mL LB液體培養基中（含50 μg·mL-1Kan，20 μg·mL-1Rif抗生素, 20 μmol·L-1乙酰丁香酮），繼續培養使農桿菌濃度達到OD600= 0.4～0.6，室溫離心（5 000 r·min-1，10 min）收集菌體，用MS液體培養基（含10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1乙酰丁香酮），重新懸浮菌體，將農桿菌濃度調至OD600= 0.4或0.8后，28 ℃ 靜置2 h后，進行注射。

1.4 侵染體系的建立 在苦瓜幼苗長至兩葉一心期時，將幼苗頂端分生組織用新刀片切去，僅留有子葉（圖1），將農桿菌懸浮液用微量注射器注射至幼苗傷口處，注射的量以不溢出幼苗傷口為準；將蘸有懸浮液的脫脂棉球置于傷口處保濕，黑暗條件下25 ℃放置2 d后，光周期為16 h（光照）/8 h（黑暗）條件下培養繼續培養，培養時溫度為25 ℃，直至植株再生。當切口處出現再生現象時，用手持式熒光儀觀察是否有紅色熒光信號，將有熒光信號的植株持續培養至葉片展開，進行分子檢測確定陽性植株。

圖1 非組培方式的苦瓜再生方法示意圖

1.5 陽性植株的鑒定 對再生的葉片進行取樣，利用CTAB法提取DNA，以引物對DsRed-F（5′-GGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAG-3′）和DsRed-R（5′-ACCTTGTAGATGAAGCAGCCGTCCT3′），進行PCR，程序是：95 ℃ 預變性 5 min；95℃ 變性 30 s，58 ℃ 復性 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，34個循環后，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。對PCR產物進行 1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，含有目的條帶的即為陽性植株。

1.6 統計分析 實驗數據采用Microsoft Excel 進行統計，IBM SPSS Statistics 20 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同接種濃度對植株再生率的影響 為了找到合適的農桿菌接種濃度，選取2個不同的濃度（OD600= 0.4或0.8）進行接種實驗（供試受體為‘K122’）。結果顯示（表1），當利用OD600= 0.8的農桿菌接種時，所含DR為AtGRF5的載體（pW-502）平均再生效率為26.67%，含DR為TaGRF4-OsGIF1的載體（pW503） 平均再生效率為33.33%，要明顯高于OD600= 0.4時菌液接種的效率（8%和5.30%）。說明農桿菌接種濃度為OD600= 0.8時利于植株再生。

表1 不同接種濃度下植株再生效率統計

2.2 不同基因型間植株再生的差異 為了明確Fast-Tracc方式誘導植株再生是否受基因型的影響，本實驗選取了‘K122’和‘K103’2個苦瓜基因型利用質粒pW502進行接種。以OD600= 0.8的濃度接種，‘K122’的平均再生效率為26.67%（質粒pW502），而‘K103’的再生效率為4.7%（質粒pW502）。結果顯示（表2），利用同一種DR誘導，在相同接種濃度下，K122的再生效率高于K103，表明不同基因型間的植株再生具有明顯差異 。

表2 不同基因型間植株再生效率統計

2.3 不同DR誘導再生的效率差異 為了明確不同DR對誘導再生效率的影響，利用含有pW502和pW503的農桿菌在OD600= 0.8時接種，‘K122’的平均再生效率分別為26.67% 和33.33%，兩者差異不明顯。而將2種農桿菌分別接種K103，平均再生效率分別為4.7%和4%，差異也不明顯。結果表明，含有2種質粒的農桿菌分別接種兩個不同基因型材料，再生效率都沒有明顯差異（表3）。

表3 不同DR誘導植株的再生效率統計

2.4 陽性再生植株的驗證 為了篩選再生植株中的陽性植株，用手持式熒光儀觀察切口處再生組織是否有紅色熒光信號，結果顯示，部分再生組織處可以觀察到紅色熒光信號（圖2）。將再生芽持續培養至葉片展開后進行取樣，提取DNA后進行PCR檢測顯示部分再生植株可以擴增出分子量為312 bp的目的片段，即為DsRed轉化成功的陽性植株（圖3）。統計結果顯示（表4），當OD600=0.8時，含有pW502或者pW503農桿菌對K122進行侵染，平均陽性率都達到10%，對‘K103’進行侵染時，則不能獲得陽性植株。

表4 陽性植株轉化效率統計

圖3 陽性植株DNA分子檢測

3 討 論

與植物組培方式的遺傳轉化相比，Fast-Tracc方式的直接再生方法步驟相對簡單，避免了傳統方法中的從愈傷組織經脫分化、再分化形成再生芽的階段[18]；費時較少，本研究從播種到植株再生約耗時50 d，而傳統離體培養則需要3個月以上，這些優點有利于對植物進行功能研究和遺傳改良，尤其是生長期較長的植物（果樹等）。

本研究雖然獲得了苦瓜轉基因陽性株，但是不能排除其是嵌合體的可能，與傳統的組培方式獲得的轉基因植株一樣，后續需要對轉基因植株后代進行進一步鑒定，篩選可以穩定遺傳的轉基因植株后代。另外，轉基因植株自交后代是否符合3∶1孟德爾遺傳規律，也需要后續進一步調查與分析。

據報道，當農桿菌接種濃度OD600= 0.2～0.3時誘導再生效率較高[19]，但是本研究中OD600=0.8有較高的誘導效率，可能是由于不同轉化方法導致的差異，前者是利用農桿菌侵染外植體進行離體培養，本研究是將農桿菌接種到切口處進行直接再生，當OD600= 0.8時可以獲得較高的誘導效率，表明該濃度的農桿菌侵染可以使苦瓜成功再生。眾所周知，不同農桿菌接種濃度，對再生效率影響較大，并且針對不同作物的最適農桿菌接種濃度也可能存在差異，因此，在對不同作物進行Fast-Tracc方式的誘導體系的建立時，需要摸索最適接種濃度。在西瓜離體培養的遺傳轉化體系的建立中，pW502和pW503誘導再生效率均高于13.00%，暗示載體中含有的AtGRF5, TaGRF4-OsGIF1可能對瓜類作物有誘導再生的作用[15]，本研究利用這兩個載體，利用Fast-Tracc方法實現了苦瓜的直接再生，進一步證明了AtGRF5, TaGRF4-OsGIF1在瓜類作物中的高效誘導再生的作用。

研究表明，在離體培養中基因型差異是影響遺傳轉化的重要因素[20]，本研究發現，K122的再生效率顯著高于K103，可能原因是基因型的差異造成的，表明在Fast-Tracc方法進行直接再生中基因型也是影響再生的重要因素之一。本實驗中最高再生率為33.33%，而陽性轉化率最高為10.00%，出現了部分假陽性苗，這可能是缺少抗性篩選所導致的。當然，此方法還有進一步改進的空間，例如苗齡，侵染菌種的選擇等。在接下來的研究中可以加入不同苗齡及不同菌種等因素進一步完善此體系，從而探索出更好的遺傳轉化體系。

本研究明確了利用含有GRF5或TaGRF4-OsGIF1的農桿菌GV3101，在OD600= 0.8時，對‘K122’的兩葉一心期進行接種，可以不通過離體培養直接再生獲得轉基因陽性植株。