動態濁度法檢測細菌內毒素方法的改進

陳曉佳 林金海 丁友玲

（福州新北生化工業有限公司 福州 350101）

細菌內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一，具有高致熱性，會引起敗血癥、休克等疾病，是藥品生產上必須嚴格控制的有害物質[1-3]。鱟試劑是從鱟的血液中提取的凍干試劑，用于檢測藥品中細菌內毒素。光度測定法分濁度法和顯色基質法，具有定量檢測、簡便、快捷、靈敏度高等優點[4-6]。動態濁度法是通過儀器測定鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化，即檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度或透光率所需要的反應時間、制備標準曲線后檢測樣品中細菌內毒素的定量檢測法。

2021 年2 月5 日，國家林業和草原局、農業農村部頒布公告，將中國鱟及圓尾鱟列為國家二級保護野生動物。為了保護鱟資源、節約鱟血細胞，在符合2020 版《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細菌內毒素檢查法”中“光度法”要求基礎上，改進動態濁度法的測定方法，鱟試劑用量由原來100 μL/次（份）減少至50 μL，比較分析樣品用量分別為50、100、150 μL 時，哪一種比例的線性和檢測范圍能達到主試劑100 μL 樣品量的水平，并通過實際樣品檢測驗證改進后的測定方法，更好地保護鱟資源和保持細菌內毒素檢測的可持續發展[7-9]。

1 材料和方法

1.1 試劑

細菌動態濁度法鱟試劑（批號22101512，規格：0.5 mL/支，檢測范圍：10～0.01 EU/mL；批號22090312，規格：0.5 mL/支，檢測范圍：10～0.03 EU/mL；批號22022612，規格：0.5 mL/ 支，檢測范圍：10～0.005 EU/mL）、細菌內毒素檢查用水（批號21100105，規格：5 mL/支，細菌內毒素含量＜0.005 EU/mL），均源自福州新北生化工業有限公司；細菌內毒素國家標準品（批號150800-201601，效價：9 000 EU/支，中國食品藥品檢定研究院）；硫酸慶大霉素注射液（批號200707，規格：2 mL ∶8 萬單位，福建匯天生物藥業有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（批號G20040704A，四川科倫藥業有限公司）；10%葡萄糖注射液（批號2012072724，辰欣藥業股份有限公司）；鹽酸林可霉素注射液（批號21110901，規格：2 mL ∶0.6 g，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司）。

1.2 儀器設備

Multiskan FC 酶標儀（Thermo Fisher Scientific Inc.）；ZH-2 混合器（天津藥典標準儀器廠）；微量移液器（北京大龍興創實驗儀器有限公司）；96 孔板（美國康寧）；細菌內毒素檢查器具（福州新北生化工業有限公司）；其他試驗玻璃器具均經250 ℃干熱滅菌0.5 h 以上除去熱原。

1.3 方法

1.3.1 3 批鱟試劑細菌內毒素動態濁度法標準曲線的可靠性試驗

依照2020 版《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細菌內毒素檢查法”中“光度測定法中標準曲線的可靠性試驗”[10]，分析標準曲線的可靠性。試驗根據所使用動態濁度法鱟試劑的檢測范圍，分別選擇3 個連續的細菌內毒素標準濃度（3 個濃度點均在鱟試劑檢測范圍內，同時包含最低檢測限，且相鄰濃度點間的稀釋倍數為10），用細菌內毒素標準品分別制成這3 個濃度的稀釋液，每一濃度做3 個平行孔，同時做2 個陰性對照。加樣量按原來100 μL/支主試劑+100 μL/支細菌內毒素溶液（或樣品），實驗結果根據線性回歸分析，計算標準曲線的相關系數r值。

1.3.2 不同反應體系對動態濁度法鱟試劑的影響

1）不同反應體系對標準曲線可靠性的影響 設置3組實驗反應體系：50+50、50+100、50+150 的反應液，按文獻[10]分析3 組實驗反應體系標準曲線的可靠性。實驗結果根據線性回歸分析，計算標準曲線的相關系數r值。

2）不同濃度內毒素反應時間的比較 通過對比鱟試劑檢測不同濃度內毒素時達到預設吸光度0.02 的時間差異，來分析50+50、50+100、50+150 的反應液相比于對照（100+100 反應液）對鱟試劑檢測靈敏性的顯著性影響。

1.3.3 樣品細菌內毒素檢測比較

按文獻[7]對比50+150、100+100 的反應液檢測鹽酸林可霉素、硫酸慶大霉素、葡萄糖、氯化鈉注射液中的細菌內毒素含量。

2 結果

2.1 3 批鱟試劑細菌內毒素動態濁度法標準曲線的可靠性試驗

根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數r的絕對值均≥0.980。動態濁度法鱟試劑批號22090312、22101512、22022612 標準曲線可靠性試驗，均符合中國藥典規定（表1）。

表1 3批鱟試劑細菌內毒素動態濁度法標準曲線的可靠性試驗結果a)

2.2 不同反應體系對動態濁度法鱟試劑的影響

2.2.1 不同反應體系對標準曲線可靠性的影響

根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數r的絕對值均≥0.980，表明3 組實驗反應體系均不影響鱟試劑（22090312、22101512、22022612）標準曲線的可靠性（表2）。

表2 不同反應體系對標準曲線可靠性的影響a)

2.2.2 不同濃度內毒素反應時間的比較

對于不同濃度內毒素反應，相對于對照（100+100 反應液）反應達到預設吸光度的時間有延長的情況。50+150反應液的反應時間沒有顯著性延長的差異。50+100、50+50 反應液的反應時間有顯著性延長的差異（圖1）。

圖1 不同反應液和不同細菌內毒素濃度對反應時間的影響

2.3 樣品細菌內毒素檢測比較

實驗結果顯示，采用50+150 的反應液檢測鹽酸林可霉素、硫酸慶大霉素、葡萄糖、氯化鈉注射液中的細菌內毒素含量，回收率均符合中國藥典規定（50%～200%），細菌內毒素含量均符合中國藥典規定（表3）。

表3 樣品細菌內毒素檢測比較

3 討論

本研究將鱟試劑的減量用于動態濁度法方法改進，成倍減少鱟資源消耗。實驗中發現，在預設吸光度值（0.02）下檢測低內毒素含量時，該方法改進反應時間明顯比文獻方法短，而稍高內毒素含量其反應時間變化不明顯。我們結合內毒素與鱟試劑進行的一系列酶反應過程分析，內毒素濃度高鱟試劑酶反應快、時間短，反之，反應慢、時間長。那么在鱟試劑半量情況下，要使反應終點達到固定吸光度的時間不出現延長，就需要相應增加反應物的量（50+150）。改進后的方法有利于反應物激活鱟試劑酶反應，顯著提高低濃度內毒素測定的靈敏性。而在高濃度內毒素的反應中考慮到操作及設備誤差、酶反應快、時間短，而使結果無明顯差異，更穩定。表明改進的方法既可保持動態濁度法原有的優點，也可提高細菌內毒素測定的靈敏性。

改進的動態濁度法，其測定結果與傳統動態濁度法一致，但可減少鱟試劑的使用量，提高鱟資源的利用率，易于在實踐中運用。進一步可著眼于其他替代檢測方法的研究及反應器具的改進等，以便在測定細菌內毒素的同時能更好地實現鱟資源的保護。