無患子皂苷的提取工藝及生物活性研究

2023-02-28 13:39:14許應生

吉林化工學院學報 2023年7期

許應生

(皖西衛生職業學院藥學系,安徽六安 237005)

無患子以其特殊的化學成分受到社會相關領域的普遍關注[1]。無患子中包含大量的皂苷成分,可用于表面活性劑制備[2];無患子還具備一定的醫學功效[3],能夠有效實現抗菌消炎、鎮痛、降壓等作用;同時無患子皂苷還可應用在部分女性衛生用品內[4]。

劉俊宏等人研究了無患子皂苷提取工藝[5],但是該工藝所使用的粗提取液中包含大量雜質,并不能全面體現無患子皂苷的應用性;劉長姣等人研究了纖維素酶-乙醇結合法的皂苷提取工藝[6],但該工藝研究過程中并未考慮無患子皂苷的生物活性;包瑞敏等人研究了黃精總皂苷提取工藝[7],但該工藝需使用大量溶劑,工藝較為復雜。

針對上述問題,研究無患子皂苷的提取工藝及生物活性,希望通過該研究為無患子的開發與利用提供更精準的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

在提取無患子皂苷時,采用的材料和試劑分別為98%齊墩果酸標準品(北京萬佳首化生物科技有限公司)、95%含量,優級純乙醇(滄州汝新化工貿易有限公司)、優級純正丁醇(聊城宇澤化工產品有限公司)、優級純冰乙酸(滄州汝新化工貿易有限公司)、優級純甲醇(滄州汝新化工貿易有限公司)、優級純香草醛(滄州汝新化工貿易有限公司)、優級純高氯酸(濟南卓普化工科技有限公司)、優級純氯化鈣(西安晉湘藥用輔料有限公司)、優級純七水硫酸鎂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、埃希氏大腸桿菌培養基(青島億信檢測技術服務有限公司)、金黃色葡萄球菌培養基(青島億信檢測技術服務有限公司)、紅色毛蘚菌培養基(青島億信檢測技術服務有限公司)、痤瘡丙酸桿菌培養基(深圳微生物菌種檢測中心)。

在實驗過程中使用的主要儀器有:CG55SH電動微型粉碎機(佛山市南海力灝工具設備制造有限公司)、UV1700雙光束紫外可見分光光度計(愛色麗(上海)色彩科技有限公司)、RE-201D旋轉蒸發器(上海耀裕儀器設備有限公司)、FA2204B實驗室高精密萬分之一分析天平(蘇州金鉆稱重設備系統開發有限公司)、DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(佛山市南海力灝工具設備制造有限公司)、HWS-26數顯恒溫水浴鍋(天津市遠洋機電科技有限公司)、KQ-100DE數控超聲波清洗器(天津市遠洋機電科技有限公司)、YL-NDSX抽濾機(德州望景環保設備有限公司)、TB-624572121910布氏漏斗(北京深維智信科技有限公司)、梨形250 mL分液漏斗(南京康洛達實驗科技有限公司)、具塞三角燒瓶250 mL錐形瓶(泰州市奧倫科技有限公司)、500 mL容量瓶(泰州市奧倫科技有限公司)、500 mL三頸燒瓶(泰州市奧倫科技有限公司)。

1.2 無患子皂苷的提取工藝

1.2.1 無患子皂苷的提取

通過電動微型粉碎機粉碎處理無患子果皮,利用實驗室高精密萬分之一分析天平稱取固定質量的野生無患子果皮或粉末,置于三頸燒瓶內,并在其中添加相應的無水乙醇溶液與蒸餾水,利用集熱式恒溫磁力攪拌器令燒瓶內溶液完全混合,設定攪拌時間與攪拌溫度分別為60 min和65 ℃。攪拌完成后,在室溫環境下靜置20 min,然后倒出上清液。三頸燒瓶內剩余溶液中加入一定比例的乙醇溶液,利用抽濾機對三頸燒瓶內剩余溶液實施抽濾處理,取濾液,循環實施此過程兩次后,將所采集的濾液合并在一起置于容量瓶內進行烘干,溫度設置為100 ℃,烘干后,過濾處理[8,9]。利用旋轉蒸發器蒸發過濾處理的剩余濾液,設定蒸發器轉速與溫度分別為55 r/min和80 ℃,共進行三次蒸發,待濾液變為棕黃色膠狀物停止蒸發,由此獲取無患子皂苷粗提物。

1.2.2 無患子皂苷粗提取液的萃取

取無患子皂苷粗提物80 mL,置于錐形瓶內,加入160 mL的石油醚,混合均勻進行萃取,連續萃取3次,合并下層皂苷水溶液,將錐形瓶置于水浴鍋內,設定時間與溫度分別為10 min和55 ℃。將溶解后的無患子皂苷粗提物倒入分液漏斗內,并用正丁醇萃取[10]。待溶液分層后,取出上層置于容量瓶內。在下層溶液內再次進行最大程度萃取,直至正丁醇相幾乎沒有顏色,合并正丁醇相,將二次提取所得萃取皂苷層置于容量瓶內。利用旋轉蒸發器蒸發兩次萃取所得溶液,設定溫度與轉速分別為80 ℃和55 r/min,在濃縮液中加入適量氫氧化鈣,攪拌1 h,去除黏液質、鞣質等,抽濾并向濾液中加入2倍體積的丙酮,自然沉淀,抽濾、烘干即可得淡黃色無患子皂苷粉末,其為無患子皂苷精產品。

1.2.3 無患子皂苷固形物含量的測定

測定無患子皂苷精產品固形物含量過程中,利用實驗室高精密萬分之一分析天平稱取20 mL無患子皂苷精產品,取無水、恒重試管裝取無患子皂苷精產品進行蒸干處理,設定溫度、真空度與時間分別為65 ℃、95.8±2.6 kPa和24 h。取出試管于室溫冷卻,利用分析天平秤至恒重。

1.2.4 無患子皂苷得率與純度計算

選取齊墩果酸為標準品繪制標準曲線。標準曲線繪制過程如下:

稱取20 mg齊墩果酸標準品,利用甲醇溶液獲取200 mL標準品溶液[11]。在六只比色管內分別添加0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的標準品溶液,將全部比色管置于數顯恒溫水浴鍋內,設定溫度為65 ℃,待比色管內的甲醇全部揮發后,在其中分別添加0.4 mL的5%香草醛-冰乙酸融合溶液與1.6 mL的高氯酸顯色劑,待全部溶液混合后,將溫度升至75 ℃后加熱15 min。取出比色管冷卻后在其中滴入10 mL乙酸乙酯,令其與管內液體全部融合。選取空白溶液作對照,利用雙光束紫外可見分光光度計進行光譜掃描[12],確定吸收波長上限值為吸光度檢測波長。根據標準品質量濃度和吸光度繪制標準曲線,并根據該曲線構建回歸方程。

利用回歸方程計算無患子皂苷含量[13]。利用式(1)與式(2)分別確定無患子皂苷得率與純度。

(1)

式(1)中,Dw表示無患子皂苷得率;Hw表示無患子皂苷質量;Gw表示無患子果皮質量。

(2)

式(2)中,Cw表示無患子皂苷純度;Xw表示固形物質量。

1.3 無患子皂苷的生物活性

1.3.1 無患子皂苷去污力檢測

利用分析天平稱取33 g氯化鈣和49.4 g七水硫酸鎂,并與20 L蒸餾水混合,取2 L混合溶劑稀釋至20 L即可獲取250 ppm硬水。采用250 ppm硬水將無患子皂苷精產品與標準洗衣粉制備成相應溶液,各溶液內均含0.2%表面活性劑。

在檢測無患子皂苷溶液和標準洗衣粉溶液去污力前,先采用光電比色計,通過反射光強度讀取污布面的白度[14]。將污布分割為大小一致的12塊圓布,利用光電比色計讀取各塊污布正反兩面5個部位的反光度,以其均值作為污布泛光度。污布洗滌過程中,在洗滌機的12只瓶內分別倒入250 mL制備好的表面活性劑溶液(無患子皂苷溶液和標準洗衣粉溶液),將溶液預熱至40 ℃左右,將污布放入溶液內,設定轉動時間與溫度分別為1 h和40 ℃。取出污布并利用自來水清洗,清洗次數2次以上,清洗結束后將各塊污布自然晾干,再次利用光電比色計讀取污布面的白度值。

1.3.2 無患子皂苷抑菌活性檢測

通過菌株活化處理制備菌懸液并置于冰箱內,設定溫度為5 ℃,備用。選取試管二倍稀釋法檢測無患子皂苷抑菌活性[15],在判斷抑菌活性時設定:各培養基表層存在菌落說明有細菌存在;不存在菌落說明無細菌存在。

1.3.3 無患子皂苷抗氧化活性測試

按照羥自由基測試盒所標明的測試方法,將無患子總皂苷配制成不同濃度的樣品溶液待測。配制樣品溶液為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0 mg·mL-1,反應體系稀釋倍數為10倍。因此最終濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·mL-1。以3% H2O2為參比,在550 nm下測定吸光度值,比較無患子皂苷與3% H2O2清除羥自由基的能力強弱,羥自由基的去除率越高,則說明抗氧化活性越好。

2 實驗結果

2.1 無患子皂苷的標準曲線

按照1.2.4項方法進行實驗,以無患子皂苷濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制齊墩果酸標準曲線,回歸得到方程A=0.441 4C+0.031 7,其中C為無患子皂苷濃度,A為吸光度。根據吸光度和無患子皂苷濃度的關系,繪制曲線圖如圖1所示。

無患子皂苷濃度/(μg·mL-1)圖1 無患子皂苷的標準曲線

圖1中R2為擬合程度指標,范圍從0到1,越接近1表示模型對數據的擬合程度越好。

根據圖1可知,符合朗伯-比爾定律,無患子皂苷的吸光度與濃度呈現較好的線性關系。

2.2 影響無患子皂苷萃取因素的確定

2.2.1 無患子果皮顆粒度對無患子皂苷純度的影響

表1所示為無患子果皮原料未進行粉碎處理與進行粉碎處理狀態下對無患子皂苷純度的影響。

表1 無患子果皮原料顆粒度對無患子皂苷純度的影響

分析表1得到,相較于未進行粉碎處理的無患子果皮原料,粉碎處理原料后,所得無患子皂苷的純度從28.2%提高到34.2%,水提液的固含量從11.6 g·mL-1提高到12.9 g·mL-1。同時,無患子果皮原料的顆粒度過低也會在一定程度令提升雜質浸出量增大,增加分離萃取過程的難度。因此在實際無患子果皮原料粉碎處理后,篩分粒度為20～60目藥粉備用。

2.2.2 乙醇濃度對無患子皂苷得率的影響

無水乙醇溶液濃度/%圖2 無水乙醇溶液濃度與無患子皂苷得率間的相關性

分析圖2能夠得到,無水乙醇溶液濃度在20%～70%區間范圍的條件下,無患子皂苷得率隨著無水乙醇溶液濃度的增加而增大,呈現正相關;在無水乙醇溶液濃度達到70%時,無患子皂苷得率達到上限值,約為15.70%;當無水乙醇溶液濃度高于70%時,無患子皂苷得率隨著無水乙醇溶液濃度的增加而降低,呈現負相關。產生這種現象的主要原因是無水乙醇溶液濃度的提升導致溶劑極性下降,雜質溶出量顯著提升。基于以上分析可知,在粗提取無患子皂苷過程中,最優無水乙醇溶液濃度為70%。

2.2.3 固液比對無患子皂苷粗提取過程中皂苷含量的影響

表2 固液比對無患子皂苷粗提取過程中皂苷含量的影響

2.2.4 萃取比對無患子皂苷萃取過程中皂苷含量的影響

表3 萃取比例對無患子皂苷萃取過程中皂苷含量的影響

2.3 生物活性檢測結果

2.3.1 去污力檢測

對本文方法所提取的無患子皂苷濃縮液進行發酵處理,并分析無患子皂苷濃縮液與無患子皂苷發酵液對炭黑污布、蛋白污布與皮脂污布的去污性能,所得結果如圖3所示。

污布類型圖3 無患子皂苷針對不同類型污布的去污能力

分析圖3可知,無患子皂苷濃縮液對炭黑污布、蛋白污布和皮脂污布的去污力分別為81%、56%和63%;而無患子皂苷發酵液對三類污布的去污力分別為98%、67%和70%。由此可知相較于無患子皂苷濃縮液,發酵后的無患子皂苷液去污性能更好。

2.3.2 抑菌性檢測結果

對本文方法所提取的無患子皂苷濃縮液進行發酵處理,并分析無患子皂苷濃縮液與無患子皂苷發酵液對各類菌懸液內細菌的抑制性能,所得結果如圖4所示。

細菌類型圖4 無患子皂苷針對不同類型細菌的抑制能力

分析圖4可知,無患子皂苷濃縮液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌和紅色毛癬菌的最低抑菌濃度分別為22、19、2和1 mg·mL-1;而無患子皂苷發酵液對四類細菌的最低抑菌濃度分別為22、12、2和0.5 mg·mL-1。以上數據充分說明相較于無患子皂苷濃縮液,發酵后的無患子皂苷液的抑菌性更好,對于金黃色葡萄球菌與紅色毛癬菌的抑制性能更優。

2.3.3 抗氧化活性檢測結果

按照無患子皂苷抗氧化活性測試步驟,得到抗氧化活性檢測結果,如表4所示。