余氯對(duì)小球藻和錦鯉的毒性效應(yīng)研究

馬原野， 丁 誼， 李自榮， 趙珊珊

(1.信陽市南灣水庫事務(wù)中心， 河南信陽 464000； 2.信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院， 河南信陽 464000)

氯制劑作為一類常用的消毒劑被廣泛地應(yīng)用在人們的日常生活和生產(chǎn)中。 當(dāng)前，生活污水、工業(yè)廢水及農(nóng)業(yè)面源污染使得自然水體含有較高的余氯，尤其在養(yǎng)殖業(yè)，氯制劑的使用更加頻繁，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，常使用氯制劑對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行消毒，以便消除養(yǎng)殖環(huán)境中的病原或病原宿主， 來切斷病害的水平傳播途徑[1]。 此外，由于自然水域含有高濃度的余氯， 在注水或換水過程中往往也使養(yǎng)殖水體賦加了過量的氯。

小球藻是一種單細(xì)胞藻類， 在自然界中分布范圍廣泛。 另外， 小球藻也是重要的生物指示物種之一，對(duì)環(huán)境污染的反應(yīng)非常靈敏，因此其被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究中。 已有研究結(jié)果表明，不同濃度的余氯會(huì)對(duì)小球藻的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生影響， 而且小球藻會(huì)對(duì)低濃度的余氯表現(xiàn)出一定適應(yīng)性， 使其生長(zhǎng)加快，藻細(xì)胞濃度上升[2]，但到達(dá)一定濃度以后，余氯毒性累積表現(xiàn)出抑制效應(yīng)[3]。

余氯對(duì)魚類的呼吸、鰓組織、血紅蛋白含量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響[4]，而且不同濃度的余氯會(huì)對(duì)魚苗產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)[5]，余氯可以使魚類的活動(dòng)減緩和鰓絲損傷、死亡等危害[6]。

基于以上原因， 為了深入探究不同濃度余氯對(duì)魚類和藻類的影響，本實(shí)驗(yàn)以常見的藻類和魚類，即以小球藻和錦鯉為例， 驗(yàn)證余氯對(duì)魚類和藻類的毒性效應(yīng)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)余氯控制、減少余氯對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物和養(yǎng)殖環(huán)境的影響提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

f/2培養(yǎng)基：微量元素、維生素、硅酸鈉（10 mg/L）、硝酸鈉與磷酸二氫鈉復(fù)合物、蒸餾水；篩選來自信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)繁育基地的錦鯉約150尾 （10 g/尾）、500 mL錐形瓶、小球藻藻種、牛皮紙、皮筋、光照培養(yǎng)箱、顯微鏡、10 mL量筒、余氯檢測(cè)儀、玻璃棒、廣口瓶、移液器、浮游植物計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、塑料箱、充氣泵、蓋玻片、載玻片、解剖刀、標(biāo)簽紙。 試驗(yàn)用于配制余氯溶液的次氯酸鈉（活性氯含量≥7.5%）購(gòu)自鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 余氯母液的配制方法

取2 mL次氯酸鈉溶液加入量筒中， 再加入8 mL的蒸餾水中稀釋5倍。 隨后取10 mL稀釋后的溶液倒入盛有7 L經(jīng)過充分曝氣的自來水中，用玻璃棒攪拌均勻，取10 mL經(jīng)充分曝氣的自來水加入比色瓶中調(diào)零，調(diào)零后加余氯檢測(cè)試劑(HR)，搖勻至無粉末狀顆粒后擦干，放入余氯檢測(cè)儀中，計(jì)時(shí)1分鐘后讀數(shù)，讀出余氯濃度為8.79 mg/L。 以此余氯母液濃度按一定比例稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度即可。

1.2.2 小球藻的毒性試驗(yàn)方法

余氯濃度的設(shè)置：根據(jù)黃洪輝等研究，當(dāng)余氯濃度低于0.02 mg /L時(shí)， 對(duì)海洋生物的毒性作用非常小[7]。 因此，當(dāng)余氯濃度低于0.02 mg /L時(shí)毒性試驗(yàn)不予考慮。 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：藻類在0.1-1.5 mg/L的余氯濃度下，小球藻的生長(zhǎng)情況差別不明顯。 因此，本實(shí)驗(yàn)中余氯濃度分別設(shè)置為A：0 mg/L、A1：0.5 mg/L、A2：1.0 mg/L、A3：1.5 mg/L、A4：2.0 mg/L、A5：2.5 mg/L、A6：5.0 mg/L、A7：7.5 mg/L。

在余氯對(duì)小球藻的毒性實(shí)驗(yàn)中， 首先按照f/2培養(yǎng)基配方，配制f/2培養(yǎng)基，隨后在每一實(shí)驗(yàn)組的錐形瓶中倒入350 mLf/2培養(yǎng)基溶液， 然后分別在每組錐形瓶中接入1 mL的小球藻藻種，混合均勻后，再加入不同濃度的余氯溶液， 經(jīng)計(jì)算每個(gè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組錐形瓶中需要加入余氯溶液的體積分別為：0 uL、28.5 uL、56.8 uL、85.3 uL、113.8 uL、142.3 uL、284.3 uL、426.5 uL，隨后將各錐形瓶中的溶液搖晃混勻，用牛皮紙包扎好， 打亂順序， 隨機(jī)將錐形瓶放入光照培養(yǎng)箱中，光照周期為12L∶12D。每天手動(dòng)搖晃錐形瓶3次。分別在培養(yǎng)至24 h、96 h時(shí)，將不同組錐形瓶中的藻細(xì)胞培養(yǎng)液充分搖勻， 取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組錐形瓶中的液體1 mL放入離心管中， 搖勻后用移液器吸取100 uL液體到浮游植物計(jì)數(shù)板中， 在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 錦鯉的毒性試驗(yàn)方法

余氯濃度的設(shè)置：根據(jù)林可椒等研究，當(dāng)余氯濃度低于0.02 mg /L時(shí)， 對(duì)魚類產(chǎn)生的毒性作用較小[8]。在此，當(dāng)余氯濃度低于0.02 mg /L 時(shí)毒性試驗(yàn)不予考慮。 預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：余氯濃度在0.1-1.5 mg/L時(shí)， 對(duì)錦鯉產(chǎn)生毒性作用較小，12 h、24 h、48 h時(shí)間段內(nèi)錦鯉正常游動(dòng)， 沒有死亡現(xiàn)象。 基于以上因素，余氯濃度設(shè)置分別為：0（對(duì)照組）B：0 mg/L、B1：0.5 mg/L、B2：1.0 mg/L、B3：1.5 mg/L、B4：2.0 mg/L、B5：2.5 mg/L、B6：5.0 mg/L、B7：7.5 mg/L。

在余氯對(duì)錦鯉的毒性實(shí)驗(yàn)中， 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)首先將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)塑料箱加7 L經(jīng)過曝氣2天的自來水， 然后經(jīng)過計(jì)算，在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中分別加入的余氯體積為：0 uL、570 uL、1135 uL、1705 uL、2275 uL、2845 uL、5685 uL、8530 uL，用玻璃棒攪拌均勻，隨后在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每個(gè)塑料箱中分別放入4條錦鯉（來自信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)繁育基地， 規(guī)格約10 g/尾）， 分別在24h、48h時(shí)觀察錦鯉活動(dòng)狀況、存活情況，并在48h后分別取每個(gè)塑料箱中仍存活的錦鯉1條，并剪取適量鰓絲，在顯微鏡下觀察錦鯉鰓絲損傷情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻的生長(zhǎng)情況

在24 h和96 h觀察不同余氯濃度下錐形瓶中小球藻的生長(zhǎng)情況（圖1A、B）。 結(jié)果表明，小球藻對(duì)余氯具有一定的敏感性，在24 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小球藻生長(zhǎng)狀況逐漸呈現(xiàn)出差異性， 當(dāng)余氯濃度≤0.5 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)狀況良好，培養(yǎng)液顏色為淺綠色，當(dāng)余氯濃度為1.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)液顏色變淺，為淡綠色，余氯濃度＞1.0 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)開始受到明顯抑制， 培養(yǎng)液無色； 在96 h時(shí)， 當(dāng)余氯濃度≤1.0 mg/L時(shí)， 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小球藻生長(zhǎng)狀況相似， 培養(yǎng)液顏色均為深綠色， 當(dāng)余氯濃度＞1.0 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)受到明顯抑制，培養(yǎng)液無色。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組24 h（A）和96 h（B）小球藻生長(zhǎng)情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從24 h至96 h，小球藻對(duì)低濃度余氯呈現(xiàn)出一定適應(yīng)性，且小球藻生長(zhǎng)速度加快，藻細(xì)胞濃度上升，培養(yǎng)液顏色由淺綠色變?yōu)樯罹G色，但小球藻在高濃度的余氯下生長(zhǎng)受到明顯抑制， 培養(yǎng)液顏色不發(fā)生變化，仍為無色。

2.2 小球藻對(duì)余氯的敏感性

在本實(shí)驗(yàn)中，在24 h、96 h，對(duì)各組單位體積小球藻培養(yǎng)液中小球藻數(shù)量進(jìn)行了顯微計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 24 h和96 h時(shí)各組小球藻的數(shù)量（1＊10^6）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一時(shí)間內(nèi)，小球藻在不同濃度余氯下， 其生長(zhǎng)狀況存在明顯差異。 余氯濃度為0.5 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比，余氯對(duì)小球藻的生長(zhǎng)出現(xiàn)了促進(jìn)作用，但當(dāng)余氯濃度＞0.5 mg/L，余氯對(duì)小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制， 且余氯濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速率比對(duì)照組下降50%以上， 出現(xiàn)了明顯的抑制效應(yīng)。 此外，培養(yǎng)時(shí)間從24 h到96 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小球藻在相同濃度的余氯下，生長(zhǎng)狀況也出現(xiàn)明顯差異。 當(dāng)余氯濃度≤1.5 mg/L時(shí)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，小球藻數(shù)量急劇增加，而當(dāng)余氯濃度＞1.5 mg/L，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，小球藻數(shù)量出現(xiàn)了明顯下降。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻對(duì)余氯的敏感性較高，余氯濃度的提高和攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)加劇對(duì)其生長(zhǎng)的抑制。

2.3 余氯對(duì)錦鯉的毒性效應(yīng)

在本實(shí)驗(yàn)中，在24 h和48 h分別對(duì)不同余氯濃度下的錦鯉活動(dòng)情況進(jìn)行了觀察。 在24 h時(shí)，觀察錦鯉的活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度的余氯對(duì)錦鯉活動(dòng)、存活產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)余氯濃度≤1.5 mg/L，錦鯉的活動(dòng)正常，當(dāng)余氯濃度＞1.5 mg/L，錦鯉活動(dòng)異常，時(shí)而性情急躁，時(shí)而游動(dòng)緩慢，多在水上層游動(dòng)，且在余氯濃度為7.5 mg/L時(shí)，錦鯉出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。 在48 h時(shí)，觀察錦鯉的活動(dòng)情況發(fā)現(xiàn)，當(dāng)余氯濃度≤1.5 mg/L，錦鯉亦正常活動(dòng)， 但當(dāng)余氯濃度為5.0 mg/L和7.5 mg/L時(shí)，錦鯉的活動(dòng)異常緩慢，身體側(cè)游，并且死亡率逐漸上升。

余氯可以使魚鰓組織增生，并且積滿黏液，在錦鯉受余氯污染的影響方面， 錦鯉的主要表現(xiàn)為活動(dòng)減緩、性情暴躁、鰓絲受損、魚體表面黏液增多、缺氧、死亡等毒性反應(yīng)[9]。 本實(shí)驗(yàn)中，在48 h分別取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中錦鯉一條， 取鰓絲并在顯微鏡下進(jìn)行觀察（圖2）。從圖中可以看出，余氯濃度為1.5 mg/L時(shí)對(duì)錦鯉鰓絲產(chǎn)生的影響不明顯，鰓絲顏色正常，沒有潰爛。 余氯濃度＞1.5 mg/L時(shí)，余氯對(duì)錦鯉的鰓絲產(chǎn)生了損傷，錦鯉的鰓絲出現(xiàn)發(fā)白，顏色變淡，甚至出現(xiàn)爛鰓現(xiàn)象。 因此，在對(duì)水體進(jìn)行消毒時(shí)，應(yīng)當(dāng)采取適當(dāng)措施控制余氯含量，防止余氯超標(biāo)，進(jìn)而對(duì)水生生物產(chǎn)生不良影響。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組48 h錦鯉鰓絲狀況顯微觀察

2.4 余氯對(duì)錦鯉死亡率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 培養(yǎng)時(shí)間在24 h， 余氯濃度為7.5 mg/L時(shí)，錦鯉的死亡率達(dá)到50%，而對(duì)照組和其他實(shí)驗(yàn)組的錦鯉均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。 培養(yǎng)時(shí)間在48 h時(shí)， 當(dāng)余氯濃度為5 mg/L， 錦鯉的死亡率達(dá)到50%，而當(dāng)余氯濃度上升至7.5 mg/L時(shí)，錦鯉的死亡率達(dá)到100%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度余氯對(duì)錦鯉的毒性效應(yīng)非常明顯， 余氯濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加都會(huì)導(dǎo)致其死亡率增加。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以小球藻和錦鯉為例， 我們初步了解到余氯對(duì)藻類和魚類產(chǎn)生的影響， 并發(fā)現(xiàn)余氯對(duì)藻類和魚類的毒性效應(yīng)存在濃度和時(shí)間依賴性， 亦即過高的余氯濃度會(huì)對(duì)藻類和魚類在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生損傷或引起死亡， 而藻類和魚類長(zhǎng)時(shí)間暴露在較低濃度的余氯環(huán)境中時(shí)也會(huì)對(duì)其造成損傷，甚至引起死亡。