煙草青枯病的生物防治室內對峙試驗

陸錚錚

（遵義師范學院，貴州 遵義 563002）

煙草青枯病是煙草上的三大病害之一［1］，是由青枯雷爾氏菌（RalstoniasolanacearumE.F.Smith）引起的一種土傳病害，該病害在貴州廣泛發生和流行，且常與其他根莖部病害（如黑脛病等）混合發生，造成75% 甚至更高的發病率，導致煙葉減產50%～60%［2］，嚴重影響煙草種植業的發展。烤煙已成為貴州遵義地區農民脫貧致富、鄉村振興的重要產業。煙草青枯病的發病率較高，目前對煙草青枯病的防治以化學防治為主，但化學農藥阻礙了煙葉品質的提升。煙草青枯病的綠色生物防治方法對于改善煙葉的品質有較高的研究價值，因此，采用平板對峙試驗篩選根圍土壤中的拮抗放線菌、常用的中藥和植物源水粗提液，為煙草青枯病的綠色防治提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 采集遵義市務川縣茅天鎮紅星村煙草種植區中煙草青枯病植株，帶回實驗室采用平板劃線分離法分離、純化。采用柯赫氏法則獲得煙草青枯病病原菌后，用斜面保存方法進行保存備用。

1.1.2 供試根圍土壤 遵義市務川縣茅天鎮紅星村煙草種植區中有青枯病發病煙田中健康煙株的根圍土壤。

1.1.3 供試中藥 供試中藥共32 種，購于遵義市中醫院和洪永藥店，中藥的名稱和供試濃度詳見表1。

表1 供試中藥名稱及供試濃度 g/mL

1.1.4 供試植物源 供試植物源共27 種，市購，植物源的名稱和供試濃度詳見表2。

表2 供試植物源名稱及供試濃度 g/mL

1.1.5 試驗過程中使用的培養基

1）病原菌分離。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（NA）：牛肉膏3～5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20～25 g、蒸餾水1 000 mL。

2）土壤放線菌的分離。高氏合成1號培養基：可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 15～25 g、水1 000 mL。

3）放線菌純化。燕麥粉瓊脂培養基：燕麥片30 g、瓊脂17～20 g、水1 000 mL。

4）對峙試驗。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（NA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL［3］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 平板劃線分離法［3］：取一小塊病組織，經75%酒精溶液和0.1%升汞溶液表面消毒后，用無菌水清洗3 次，置于無菌水中，用滅菌解剖刀將組織切碎。靜置1 min 后，用滅菌的接種環蘸取上組織液在NA 平板上劃線分離。置于32 ℃恒溫培養箱培養3 d后，挑取單個菌落進行純化培養。

1.2.2 土壤采集和放線菌分離 在有青枯病的煙田，選健康煙株的根圍土壤，除去地面的落葉和垃圾，撥開表土約深5 cm，每土樣約30 g，裝入自封袋并做上記號，帶回實驗室。

采用稀釋平板法分離土壤中放線菌［3］：土壤放于干燥無菌的地方下晾7 d 后，稱取土樣10 g，放入裝有90 mL 無菌水和玻璃珠的三角瓶中，置于搖床震蕩20 min，靜置20～30 s，即成10-1土樣稀釋液。吸取10-1土樣稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無菌水的試管中，混勻、稀釋，即成10-2稀釋液。依此類推，制備稀釋倍數為10-2、10-3、10-4。分別取不同濃度的稀釋液0.1 mL 分散的放置于對應濃度標記的高氏合成1號培養基中，用玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻。放置20 min 后，倒置于28 ℃培養箱培養7 d。待放線菌的菌落形成后用滅菌的牙簽小心的挑取菌體轉移至燕麥培養基上進行純化、備用。

1.2.3 中藥液的配置 將中藥粉碎成粉末狀，稱取粉末至于三角瓶中制備成所需濃度的中藥液體，放置于滅菌鍋滅菌即可。

1.2.4 植物水粗提液的制備 將新鮮樣品用去離子水沖洗凈并瀝干表面水分、切碎。稱取相應的樣品放入滅菌的研缽中，加入相應的無菌水制備成所需的濃度，然后研磨成漿。2層紗布過濾，將得到的濾液5 000 r/min 離心5 min，取上清液。用0.22 μm 孔徑枕針頭式細菌過濾器進行過濾、除菌，即為植物水粗提液［4］。

1.2.5 拮抗放線菌、中藥和植物源的篩選

1）拮抗放線菌的篩選。用滅菌的牙簽挑取待測放線菌菌體接種在PDA 平板中央，置于28 ℃恒溫培養箱培養，7 d后用無菌的噴壺將濃度為3×108cfu/mL 的煙草青枯菌懸液噴入接有待測菌的PDA 上，靜置20 min，將平板倒扣置于30 ℃恒溫培養箱培養，24 h 后觀察并測量抑菌圈的直徑。以PDA 平板上不接任何菌只噴有青枯菌的平板為對照，每種待測放線菌3個重復。

2）中藥和植物源的篩選。將青枯病菌均勻的在NA 培養基上進行劃線，然后將直徑為5 mm 的無菌中性濾紙碟浸泡在中藥液或者植物水粗提液中15 s，用鑷子取出濾紙碟，將剩余的藥液瀝干，然后將吸附了藥液的3張濾紙碟重疊放入上述NA 培養基中央，輕按壓使其服帖，每種藥液或者植物水粗提液3 個重復，以無菌水浸泡的濾紙碟為對照。做好標記，放入32 ℃的恒溫培養箱中培養30 min 后將培養基倒扣繼續培養24 h后觀察、測量。

1.2.6 抑菌圈的測量 測量抑菌圈直徑的大小（以mm為單位），計算其平均值。

抑菌圈直徑=［（長直徑-放線菌直徑或者濾紙碟直徑）+（短直徑-放線菌直徑或者濾紙碟直徑）］/2

平均抑菌圈直徑=重復的抑菌圈直徑之和/3

2 結果與分析

2.1 不同拮抗放線菌對煙草青枯病的抑制效果

從6 份土壤中共分離62 株放線菌，通過平板對峙篩選出對煙草青枯病有抑制效果的拮抗放線菌有11 株。從表3 可知，平均抑菌圈直徑最大的是放線菌F11（21.00 mm），11株拮抗放線菌的平均抑菌圈直徑為12.40 mm。

表3 11株拮抗放線菌與煙草青枯病菌對峙的平均抑菌圈直徑 mm

2.2 不同中藥對煙草青枯病的抑制效果

32 種中藥通過平板對峙篩選出對煙草青枯病有抑制效果的有27 種。從表4 可知，平均抑菌圈直徑最大的是地榆（18.00 mm），27種中藥的平均抑菌圈直徑為9.40 mm。

表4 32種中藥與煙草青枯病菌對峙的平均抑菌圈直徑 mm

2.3 不同植物水粗提液對煙草青枯病的抑制效果

27 種植物水粗提液通過平板對峙篩選出對煙草青枯病有抑制效果的有17 種。從表5可知，平均抑菌圈直徑最大的是大蒜頭（27.60 mm），17種植物水粗提液平均抑菌圈直徑為9.90 mm。

表5 27種植物水粗提液與煙草青枯病菌對峙的平均抑菌圈直徑 mm

2.4 不同室內生物防治對煙草青枯病菌的對峙培養效果

由圖1 可知，3 類室內生物防治的試驗結果表明，大蒜頭水粗提液抑菌圈直徑（27.60 mm）＞放線菌F11 抑菌圈直徑（21.00 mm）＞中藥液地榆抑菌圈直徑（18.00 mm）。平均抑菌效果來看，拮抗放線菌的平均抑菌圈直徑（12.40 mm）＞植物水粗提液平均抑菌圈直徑（9.90 mm）＞中藥液平均抑菌圈直徑（9.40 mm）。

圖1 不同室內生物防治對煙草青枯病菌對峙培養的效果

3 小結

通過抗病品種的培育、休耕輪作、物理防治和化學防治等方法防治煙草青枯病，雖然有一定的防治效果，但各項方法都存在著一定的局限性。按可持續發展的要求，生物防治無疑是一種綠色、無公害的新型防治方式，越來越受煙農的青睞。其原因如下，一是利用從根圍土壤中篩選的拮抗菌來防控病害，回接于原位生態環境中更易定殖，更易與病原菌競爭生態位點［5］，防治效果好，且綠色環保，對人畜安全。二是中藥防治在病蟲害的防治中是重要部分，隨著科技的不斷進步，我國對中藥重視程度不斷加深，可利用的中藥種類越來越多，應用領域也越來越廣泛，中藥也成為植物病蟲害防治試驗研究中不可或缺的材料［6］。三是利用植物中的殺菌抑菌活性成分，結合現代植物有效活性成分提取技術，開發以植物為原料的生物農藥具有效果好不易引起抗藥性及不污染環境等優點［7］。試驗選擇3 種生物防治的方法，通過室內篩選發現，11株煙草根圍土壤拮抗放線菌、27種中藥和17種植物源水粗提液對防治煙草青枯病菌有效，其中，大蒜頭水粗提液、放線菌F11 以及中藥液地榆對煙草青枯病的防治效果較好，其平均抑菌圈直徑分別為27.60 mm、21.00 mm、18.00 mm。

煙草青枯病生物防治方法是目前研究的熱點［8］，在利用生物防治的同時也可結合田間管理、輪作或間作等進行綜合防治。研究只探明了3類生物防治的室內防治效果，對其之間的復配以及田間的實際防治效果有待下一步研究。