浙江省金華市柑橘黃龍病檢測及柑橘木虱分布情況調查

劉順民, 呂佳, 杜丹超, 蒲占湑, 張利平, 朱莉, 黃振東, 陳國慶, 鹿連明

(浙江省農業科學院 浙江省柑橘研究所, 浙江 臺州 318020)

中國是全世界最大的柑橘生產國, 種植面積達27 701.533 hm2, 產量達4 365.57 萬t[1]。柑橘產業是浙江省農業主導產業之一, 柑橘種植品種豐富, 栽培歷史悠久[2]; 近年來, 隨著浙江柑橘產業不斷發展壯大的同時, 也面臨著諸多不利發展因素的制約, 柑橘黃龍病是威脅柑橘產業健康發展的首要因素[3]。1956 年柑橘黃龍病首次在廣東潮汕地區被報道發生[4], 隨后在亞洲、非洲、大洋洲和美洲陸續有相關報道, 截至目前該病已經擴散蔓延至全世界40 多個國家。

柑橘黃龍病菌是一種僅寄生于韌皮部組織內的革蘭氏陰性細菌, 目前還不能通過人工培養[5]。1995 年由學者GARNIER 等[6]提議統一命名為柑橘黃龍病, 之后又根據細菌學名的國際命名法將黃龍病菌分為亞洲柑橘黃龍病菌 (CandidatusLiberibacter asiatum )、非 洲 柑 橘 黃 龍 病 菌(CandidatusLiberibacter africanum) 和美洲柑橘黃龍病菌 (CandidatusLiberibacter americanum)[7-12]。研究表明, 柑橘黃龍病菌形態學上存在長條形和圓形兩種類型, 兩者致病性無較大差異, 寄主主要是柑橘屬及其蕓香科柑橘亞科近緣屬植物。除柑橘屬植物外, 枳、金柑、黃皮、九里香、澳指檬、木蘋果、酒餅簕等近緣屬植物上均有檢出黃龍病菌的報道[13-14], 并能通過人為接種方式感染長春花、菟絲子、煙草和番茄等非蕓香科植物[15-18]。不同的是, 黃龍病亞洲種和黃龍病美洲種都屬于耐熱型,在27 ～32 ℃發病癥狀明顯, 其田間傳播有相同且唯一的昆蟲媒介: 柑橘木虱。而黃龍病非洲種屬于熱敏型, 一般在22 ～24 ℃癥狀明顯, 在高于27 ℃時癥狀逐漸消失, 且媒介昆蟲為非洲木虱[19]。在中國, 柑橘黃龍病是毀滅性病害之一, 也是國內檢驗檢疫性病害之一。在柑橘各個生長期都能感染黃龍病, 感病性難易不均, 發病后可造成樹冠稀疏,植株矮化。最典型的癥狀為葉片斑駁型黃化, 在秋梢上表現最為明顯, 果實上表現為畸形變小且轉色不均的 “紅鼻子果”, 造成果實商品率降低, 嚴重時可導致整棵樹黃化枯死, 帶來巨大的經濟損失[20-21]。

20 世紀80 年代初年首次在浙江溫州平陽縣發現柑橘黃龍病, 之后調查發現柑橘黃龍病零星分布在浙江省溫州市南部地區, 且伴隨有柑橘木虱的發生[22-23]。全球氣候變暖, 為柑橘木虱向北遷移活動提供了有利的氣候條件, 加上當下苗木市場管理混亂和基層檢測能力不足等人為因素, 導致柑橘黃龍病病害分布呈逐漸向北擴大的趨勢。在21 世紀初黃龍病疫情普查中, 研究人員在除了溫州市之外的臺州、麗水兩市也發現了柑橘黃龍病, 并呈現迅速爆發的趨勢。其傳播媒介柑橘木虱的活動范圍現已遍布溫州、臺州、麗水、寧波等地[24], 基于當下柑橘黃龍疫區逐漸向北擴展和柑橘木虱向北遷移的現狀, 故開展了此次針對浙江省衢州市和金華市兩地區柑橘黃龍病及柑橘木虱發生情況調查, 通過TaqMan 探針法和實時熒光定量PCR (real-time PCR) 方法對柑橘樣品中的柑橘黃龍病菌進行檢測, 以掌握兩地黃龍病發生情況, 為兩地及周邊地區針對柑橘黃龍病及柑橘木虱防控提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2022 年9 月采集于金華市地區下轄的蘭溪市、婺城區、金東區、武義縣及永康市境內30 個柑橘果園, 通過癥狀識別的方法對柑橘黃龍病進行初步調查, 每個果園內采集3 ～5 株表現為疑似黃龍病的柑橘樹, 按每株采集5 ～10 片老熟黃化葉片作為一個樣品, 共計210 個樣品按照來源分類整理。

1.2 試劑與引物

植物基因組DNA 提取試劑盒購自杭州新景生物試劑開發有限公司; Real-time PCR 試劑Premix EXTaq(Probe qPCR) 購自寶生物工程 (大連)有限公司 (TaKaRa)。

Real-time PCR 引 物 為 HLBas: 5′-TCGAGC GCGTATGCAATACG-3′ 和 HLBr: 5′-GCGTTATCC CGTAGAAAAAGGTAG-3′, 探 針 為 HLBP: 5′-AGACGGGTGAGTAACGCG-3′ ( 5′ FAM 標 記, 3′BHQ-1 標記), 16S rDNA 序列下游引物OI2C: 5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′, 以上引物和探針均由TaKaRa 公司合成。

1.3 樣品DNA 提取

每個樣品稱取0.1 g 葉脈組織剪碎置于2 mL無菌離心管中, 放入5 mm 研磨珠, 隨后將離心管置于-40 ℃冷凍研磨機內研磨成粉末, 研磨頻率80 Hz, 研磨時間為200 s, 中斷10 s, 重復運行3次。使用杭州新景生物試劑開發有限公司植物基因組DNA 提取試劑盒進行DNA 提取, 具體操作如下: 充分研磨后加入500 μL、65 ℃預熱的Buffer PL, 充分混勻后置于65 ℃水浴鍋內10 min, 期間每隔2 ～3 min 搖晃離心管以幫助DNA 釋放; 加入350 μL Buffer K, 蓋上管蓋, 用力搖晃15 s, 渦旋振蕩30 s。13 000 r·min-1離心5 min; 離心后將上清液倒入核酸純化柱 (核酸純化柱置于2 mL 離心管中) 中, 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 在核酸純化柱中加入500 μL Buffer WA (Buffer WA 中已經加入無水乙醇), 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 在核酸純化柱中加入600 μL Buffer WB (Buffer WB中已經加入無水乙醇), 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 蓋上管蓋, 14 000 r·min-1離心1 min; 棄2 mL 離心管, 將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 mL 離心管中, 在純化柱中加入100 ～200 μL、65 ℃預熱的Buffer TE, 蓋上管蓋, 室溫靜置2 min, 12 000 r·min-1離心30 s, 棄純化柱, 洗脫的DNA 可儲存在-20 ℃備用。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測

采用TaqMan 探針法進行實時熒光定量PCR 檢測, 特異性引物為HLBas/HLBr, 探針為HLBP,以黃龍病陽性樣品的DNA 為陽性對照, 柑橘無病毒苗木樣品為陰性對照, 以ddH2O 為空白對照。Real-time PCR 檢測反應體系為20 μL, 包含2×Premix ExTaq10 μL, 250 nmol·L-1的上下游引物各1 μL, 150 nmol·L-1探針1 μL, 待測樣品DNA 1 μL, 無菌雙蒸水6 μL; 反應在Bio-Rad CFX96 PCR 儀上進行, 擴增程序如下: 95 ℃預變性2 min, 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s, 40 個循環。反應結束后, 根據實時熒光定量PCR 所檢測樣品的Ct值, 分析樣品是否感染有柑橘黃龍病菌。

1.5 黃龍病菌的PCR 片段克隆與序列分析

黃龍病菌16S rDNA 序列的特異性引物為HLBas/OI2C, 上 游 引 物 HLBas: 5′-TCGAGCGC GTATGCAATACG-3′, 下游引 物OI2C: 5′-GCCTCG CGACTTCGCAACCCAT-3′, 以 黃 龍 病 陽 性 樣 品DNA 為模板, 用上述引物進行PCR 擴增, 獲得的目的片段經過電泳, 用凝膠回收試劑盒 (TaKaRa,日本) 回收純化后, 將目的片段與pMD19-T 載體(TaKaRa, 日本) 連接, 通過熱轉化將連接產物轉化Mach1-T1 Phage Resistant 菌株感受態細胞。通過挑取單菌落經PCR 篩選后, 送上海生物工程有限公司測序分析。

1.6 柑橘黃龍病媒介昆蟲發生情況調查

蘭溪市、婺城區、金東區、永康市和武義縣是金華市下轄主要柑橘種植區縣, 調查這5 個縣市區內柑橘果園柑橘木虱發生情況并記錄果園的管理水平、柑橘木虱發生率 (發生率為有木虱發生的果園數除以調查的總果園數)、成蟲蟲口密度 (成蟲蟲口密度為成蟲個數除以調查總株數) 和有蟲株率 (有蟲株率為有木虱發生的株數除以調查的總株數)。

2 結果與分析

2.1 柑橘黃龍病菌的檢測

本次在金華市5 個縣市區的16 個鄉鎮街道共采集210 份樣品, 檢測出13 份樣品攜帶黃龍病菌,黃龍病菌檢出率達6.2%, 詳情見表1。其中永康市唐先鎮樣品檢出率最高, 達20.0%, 此外武義縣白洋街道, 婺城區洋埠鎮、羅埠鎮, 永康市花街鎮樣品檢出率均超過10.0%, 以上街道、鄉鎮均屬于柑橘黃龍病發生較為嚴重的區域。

表1 黃龍病菌實時熒光定量PCR 檢測結果

2.2 柑橘黃龍病菌測序分析比對

以HLBas、OI2C 為上下游引物, 分別用金華市蘭溪市、婺城區、武義縣和永康市4 個柑橘黃龍病陽性樣品DNA 為模板進行PCR 擴增, 電泳結果顯示擴增出1 171 bp 目的條帶, 如圖1 所示。通過對擴增產物純化回收與克隆轉化, 挑選出陽性克隆子, 將陽性克隆子送上海生物工程有限公司測序分析, 將所得序列在NCBI 中與基因庫所有序列進行比對分析, 經BLAST 結果表明, 所得序列均為亞洲柑橘黃龍病菌, 相似性均在99.5%以上。

圖1 HLBas/OI2C 引物PCR 擴增電泳圖

2.3 金華市各縣區柑橘黃龍病媒介昆蟲發生情況

從表2 可以看出, 此次調查金華市下轄的蘭溪市、婺城區、金東區、武義縣及永康市均有柑橘木虱的發生, 從調查數據可得出, 以上幾個縣市柑橘木虱發生情況不容樂觀, 特別是永康市境內柑橘木虱發生率最高, 達到83.3%。蘭溪市柑橘木虱發生密度最大, 柑橘木虱成蟲口密度為21.0 頭·株-1, 有蟲株率為41.9%。

表2 金華市各縣區柑橘木虱發生情況

2.4 不同管理水平下柑橘黃龍病媒介昆蟲發生情況

調查發現, 在管理果園和半失管 (失管) 果園均有柑橘木虱的發生分布, 在調查的30 個果園中, 有7 個果園為半失管 (失管) 狀態, 在半失管 (失管) 果園內柑橘木虱發生各項指標均高于管理果園內柑橘木虱的發生情況, 詳見表3。通過SPSS 軟件分析, 柑橘木虱發生危害情況與果園管理情況呈顯著相關性, 相關系數為0.99。

表3 不同管理情況下柑橘木虱發生情況

2.5 黃龍病與柑橘木虱發生的區域分析

金華市位于浙江省中西部, 為浙江省主要柑橘種植區之一, 從本次柑橘黃龍病檢測和柑橘木虱發生分布調查結果來看, 金華市下轄的蘭溪市、婺城區、金東區、武義縣及永康市均有柑橘木虱的發生 (圖2)。同時在以上地區均檢測到柑橘黃龍病的發生, 說明以上幾個縣市區為柑橘黃龍病和柑橘木虱發生重疊區域。相關部門應該加強與金華市蘭溪市和婺城區相鄰的周邊地區柑橘黃龍病和柑橘木虱的監測, 防止柑橘黃龍病病情外溢至衢州市境內。

3 結論與討論

柑橘黃龍病是危害柑橘的主要病害之一, 對柑橘產業造成嚴重性威脅, 該病的傳播媒介昆蟲是柑橘木虱, 柑橘木虱在取食柑橘黃龍病病株后可終生帶毒, 且傳毒效率高[25]。本次研究通過TaqMan 探針法和實時熒光定量PCR 法檢測金華市柑橘黃龍病發生情況。從檢測結果上看, 柑橘黃龍病在金華市蘭溪市、婺城區、武義縣和永康市均有不同程度發生, 而在金東區未檢測到柑橘黃龍病; 從柑橘木虱的發生調查中可看出, 柑橘木虱在金華市蘭溪市、婺城區、金東區、武義縣、永康市均有不同程度的發生, 特別是金華市永康市柑橘木虱發生率達到83.3%, 且所調查的縣市區柑橘木虱發生率均在50%以上, 屬于柑橘木虱發生嚴重區域。

根據上述結果筆者認為, 金華市柑橘黃龍病檢出率高可能與以下幾點有關: 首先金華市地處麗水市、臺州市這類柑橘黃龍病疫區周邊, 加上金華市境內柑橘苗木市場混亂無秩序, 導致未經過檢驗檢疫的柑橘苗木、接穗從疫區內流入, 特別是近幾年由于苗木市場需求大, 大量引進雜柑類品種, 這類雜柑帶病嚴重, 加快了柑橘黃龍病在金華市內的傳播速度。其次是大部分種植戶對柑橘黃龍病的認識和防范意識不足, 對果園缺乏科學有效的管理, 在面對柑橘黃龍病侵染的病株時不能進行有效判斷和識別, 無法及時挖除病株, 導致黃龍病得以快速傳播。最后是隨著全球氣候變暖, 冬季平均氣溫上升顯著以及金華市內柑橘苗木基地不同柑橘品種間放梢時間不同等環境條件給柑橘木虱提供了生存和繁殖空間, 進一步為柑橘木虱大范圍侵染提供了有利條件。從調查結果來看, 在金華地區有柑橘黃龍病發生的地方幾乎都有柑橘木虱的發生, 當同時滿足毒源、媒介昆蟲這兩個條件時, 就應該引起當地相關部門的重視, 制定相關的防控措施來遏制柑橘黃龍病的傳播。

鑒于金華市柑橘黃龍病發生情況不容樂觀, 特別是此次調查發現, 在緊鄰衢州市的金華市蘭溪市和金華市婺城區都有柑橘黃龍病和柑橘木虱發生,容易造成病情外溢, 應加大柑橘黃龍病的防控力度, 尤其是對全市各個柑橘主要產區柑橘黃龍病發生情況進行實時監測。同時針對柑橘木虱發生的特點, 加強栽培管理, 科學合理促進嫩梢增厚老熟,縮短易受木虱侵害的嫩梢期, 并且集中在發梢期加強藥劑防治, 完善統防統治的防控體系。在病區與非病區種植杉木、玉米等高稈植物, 阻礙風的流動性, 從而起到一定阻隔作用, 對木虱會有良好的控制效果, 建立防護林案例在福建永春地區防控黃龍病已取得顯著成效。

調查中還發現, 在失管或半失管的果園內, 柑橘樹勢弱, 抽梢次數參差不一, 這類果園內柑橘木虱發生率高于管理果園內柑橘木虱發生率。這說明在有人為干預管理的情況下, 果園內柑橘木虱發生危害情況得到一定控制, 但無法杜絕果園內柑橘木虱的發生, 出現該情況可能是由于距離半失管或失管果園過近, 或是在防治柑橘木虱的時候沒有進行統防統治, 柑橘木虱往返遷飛, 無法真正做到柑橘木虱的防控管理。相關部門應該做好統籌工作, 將一些失管果園進行集中處理, 才能更好地清除蟲源, 切斷柑橘黃龍病傳播鏈條。

柑橘黃龍病嚴重危害柑橘產業, 如何建立長效的柑橘黃龍病防控機制是當下的主要內容之一, 除加強規范柑橘苗木市場和防控柑橘木虱之外, 地方政府、農技部門應提高重視大力宣傳, 加大資金投入和相關人才培養, 同時轉變種植戶的固有種植觀念和管理水平, 樹立 “統防統治” 觀念, 才能將黃龍病防控有效推進。