雷州黑鴨EI24基因的遺傳多態性及與產蛋性能的相關性分析

潘藝亭,葉潤根,趙志輝,姜 平

(廣東海洋大學 濱海農業學院,廣東 湛江 524088)

中國是鴨飼養大國,飼養量約占世界總量的75%[1]。其中地方鴨種資源豐富,但地方品種的繁殖力較低[2],農民養殖數量增加,但是產出效率卻在減少[3],因此減少地方品種資源流失是亟需解決的問題。雷州黑鴨是中國雷州半島廣泛分布的鴨品種,具有適應性強、抗病力強、產蛋高峰期長、蛋齡早、蛋中微量元素豐富、耐粗飼等特點[4]。作為一個優質的地方鴨品種,其遺傳多樣性是提高肉蛋性能和環境適應性的優良遺傳材料。然而,由于農民普遍的自由放養,商業鴨苗隨機生產,缺乏規范的人工選育繁殖系統,導致個體品種和羽毛顏色的差異較大。而不穩定的遺傳和產蛋數量與質量的下降使雷州黑鴨在市場競爭中處于不利地位。

依托泊苷誘導的2.4蛋白(etoposide-induced 2.4 protein,EI24),又稱p53 誘導基因(p53-induced gene 8,PIG8),編碼一種定位于內質網(ER)的六跨膜蛋白。有研究者發現,EI24可抑制細胞生長并促進細胞凋亡[5],且EI24的缺失抑制DNA損傷誘導的細胞死亡[6]。DNA損傷時,細胞會啟動多種反應途徑,以激活DNA修復、細胞周期阻滯和凋亡[7],而DNA損傷反應可導致基因突變和癌癥發展[8]。其中DNA損傷反應中的一個關鍵角色是腫瘤抑制因子p53,在重度DNA損傷時則促進細胞凋亡[9]。而EI24表達受到腫瘤抑制蛋白p53的高度誘導[10],并且在各種癌癥中發現EI24經常丟失或突變[11-12]。有研究[13]通過免疫共沉淀和其他體外和體內EI24-Bcl-2的蛋白質與蛋白質結合測定分析表明,EI24利用其N端區域結合Bcl-2中的BH3結構域[14],進而影響細胞凋亡。此外,免疫組織化學分析表明,EI24的缺失與乳腺腫瘤的侵襲性有關[14]。這些結果表明,EI24的誘導有助于細胞凋亡過程,目前主要被認為是用于防止腫瘤擴散[15],這與其一開始作為腫瘤抑制因子的作用一致,同時EI24的mRNA在高低產雷州黑鴨卵巢中的差異表達,可能通過影響卵泡閉鎖過程,進而影響雷州黑鴨的繁殖性狀。

本試驗初步探討EI24基因的遺傳多態性與雷州黑鴨產蛋性能的關系,采用直接測序的方法驗證EI24基因的相關分子標記,為挖掘相關遺傳標記在雷州黑鴨的標記輔助選擇提供依據,為進一步構建雷州黑鴨高產核心群奠定基礎。[11]

1 材料與方法

1.1 實驗動物300日齡雷州黑鴨92只來自于湛江市坡頭區某養殖場的F4代基礎群。頸靜脈采血2 mL,用肝素抗凝管收集后,-20℃保存備用以提取血液基因組DNA。

1.2 主要試劑及儀器血液DNA提取試劑盒,購自廣州美基生物科技有限公司;瓊脂糖,購自博格林生物有限公司;Taq Master Mix,購自諾唯贊公司;凝膠成像系統,購自上海天能科技有限公司;快速梯度PCR儀,購自美國ABI公司。

1.3 全基因組DNA提取采用美基DNA提取試劑盒提取血液DNA,步驟參照試劑盒說明書,使用濃度分析儀檢測DNA濃度和純度,-20℃保存備用。

1.4 DNA混池構建隨機挑選50個DNA樣品進行等量混合,制備成DNA混池樣品。

1.5 引物設計根據Ensemble數據庫提供的EI24基因組序列(ENSAPLG00030007779),使用Primer 5.0軟件進行EI24基因的引物設計,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成:上游引物:5′-GCCTTTGCTGTCGTGATAT-3′;下游引物:5′-ATGTTCCCGTCACCTACCT-3′;

1.6 目的基因PCR擴增及驗證PCR反應體系20 μL:DNA模板1 μL,Green Taq Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL。

PCR反應程序:95℃預變性3 min;95℃變性15 s,50℃退火15 s,72℃延伸50 s,35個循環;72℃延伸5 min。

進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結果

2.1 雷州黑鴨EI24基因PCR擴增產物驗證PCR擴增雷州黑鴨EI24基因產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示,PCR產物擴增特異性良好,條帶清晰,可直接用于測序鑒定(圖1)。

1～6.為隨機6個血樣DNA的PCR擴增產物;M.DNA Marker

2.2 測序結果EI24基因PCR擴增后,通過引物在內含子5中發現了共7處SNP位點,分別為I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A、I5-385 C>T。7個SNPs的每種基因型測序結果如圖2～8所示。

1～3.基因型分別為GG、GT、TT的個體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個體

1～3.基因型分別為TT、TA、AA的個體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個體

2.3 EI24基因7個SNP位點的群體遺傳特性EI24基因中的7個SNP位點的群體遺傳特性見表1。

表1 EI24基因7個SNPs的群體遺傳特性

2.4 EI24基因SNPs與雷州黑鴨產蛋性能的相關性分析使用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對EI24基因SNPs基因型進行多重比較,結果如表2所示,在I5-17 G>T位點中,TT型的開產日齡顯著高于GT型(P<0.05);在I5-59 G>A和I5-159 G>A位點中,AA型的開產日齡均顯著高于GA型(P<0.05);在I5-110 T>A位點中,AA型的開產日齡顯著高于TA型(P<0.05);在I5-256 C>A位點中,AA型的開產日齡顯著高于CA型(P<0.05);在I5-166 G>A位點中,GG型的開產體質量極顯著低于AA型(P<0.01),顯著低于GA型(P<0.05);在I5-385 C>T位點中,CC型的開產體質量極顯著低于TT和TC型(P<0.01);7個SNPs均對開產蛋質量和300 d產蛋量無顯著影響(P>0.05)。

表2 EI24基因7個SNPs與雷州黑鴨產蛋性能相關性分析

由以上結果可見,I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A和I5-256 C>A這5個位點均與雷州黑鴨開產日齡顯著相關;I5-166 G>A和I5-385 C>T這2個位點均與雷州黑鴨開產體質量極顯著相關,說明這7個SNPs可能對提高雷州黑鴨的開產日齡和開產體質量有重要參考價值。

2.5 EI24基因單倍型與雷州黑鴨產蛋性能的關聯分析使用HaploView 4.2軟件對7個SNP位點進行連鎖分析,如圖9和表3所示,結果顯示I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A和I5-385 C>T這7個位點都存在強連鎖遺傳,7個位點構成了一個結構域,共有10種不同的單倍型,其中只有7種單倍型有生物學統計意義(個體數大于3)分別為H1H1(GGGGTTGGAACCTT)、H1H2(GTGATAGA-AACATT)、H1H3(GGGGTTGGAGCCTC)、H1H4(GGGGTTGGAACCTC)、H2H2(TTAAAAAAAAAATT)和H2H3(GTGATAGAGACACT)、H3H3(GGGGTTGGGGCCCC)。

表3 EI24基因單倍型頻率

圖9 EI24基因7個SNPs位點連鎖反應

使用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對EI24基因SNPs單倍型進行多重比較,結果如表4所示,H1H4單倍型的開產日齡顯著低于H1H1和H2H2單倍型(P<0.05);H3H3單倍型的開產體質量顯著低于H1H2、H1H4和H2H2單倍型(P<0.05),并極顯著低于H1H1和H1H3單倍型(P<0.01);H1H4單倍型的300 d產蛋量顯著高于H1H2單倍型(P<0.05)。7個單倍型均對開產蛋質量無顯著影響(P>0.05)。

表4 EI24基因單倍型與雷州黑鴨產蛋性能相關性分析

3 討論

3.1 雷州黑鴨EI24基因遺傳多態性近年來有越來越多的研究人員關注基因多態性對雷州黑鴨產蛋性能的影響,ASIAMAH等[16]采用直接測序法對雷州黑鴨ESR2基因的遺傳多態性及產蛋性能的相關性分析發現g.56805646 T>C和exon 3-20 G>A位點與開產蛋質量顯著相關。張少偉等[17]使用PCR-SSC方法檢測到雷州黑鴨FSHβ基因g.1103451A>T位點的TT型開產日齡均顯著低于AA和AT型,而開產體質量和300日齡產蛋數則顯著高于AA型,提示該位點可能促進早期產蛋和生長發育而提高雷州黑鴨的產蛋性能。因此,本試驗以EI24基因為研究對象,采用直接測序法對EI24基因的單核苷酸多態性進行檢測,并分析EI24基因SNPs或單倍型與雷州黑鴨繁殖性狀的相關性,在雷州黑鴨EI24基因的內含子5中發現了7處突變位點,并相互連鎖,形成強結構域,通過群體遺傳多態性分析表明群體處于哈代溫伯格平衡。本試驗發現雷州黑鴨EI24基因內含子5中的5個SNPs位點均與開產日齡顯著相關,2個SNPs位點均與開產體質量極顯著相關,提示EI24基因可作為雷州黑鴨開產日齡與開產體質量相關的分子遺傳標記。

3.2 雷州黑鴨EI24基因7個SNPs位點與產蛋性能的相關性蛋鴨的開產日齡、開產體質量、開產蛋質量和產蛋數是衡量產蛋性能的重要指標。本試驗圍繞雷州黑鴨EI24基因,首次發現了該基因內含子5中存在7個SNPs位點,其中I4-17 G>T、I4-59 G>A>T、I4-110 T>A、I4-159 G>A和I4-256 C>A這5個位點均與雷州黑鴨開產日齡顯著相關;I4-166 G>A和I4-385 C>T這2個位點均與雷州黑鴨開產體質量極顯著相關,說明這7個SNPs可能對提高開產日齡和開產體質量有重要指導作用。

通過SPSS22.0進行相關性分析后發現,開產日齡與開產蛋質量之間存在極顯著正相關,與產蛋數之間存在極顯著負相關;開產蛋質量與產蛋數之間存在極顯著負相關;開產體質量與開產蛋質量之間存在顯著正相關。有研究發現產蛋數與開產體質量呈遺傳負相關[15],與本次相關性分析結果相符,但H1H4單倍型兼具低開產日齡、高開產體質量和高產蛋量,因此可以從這7個SNPs位點的優勢基因型中篩選出低開產日齡、低開產體質量和高產蛋量的個體,從而提高產蛋性能和經濟效益。

本試驗發現雷州黑鴨EI24基因中I5-17 G>T的GT型、I5-59 G>A與I5-159 G>A的GA型、I5-110 T>A的TA型和I5-256 C>A的CA型可作為低開產日齡的優勢基因型;I5-166 G>A的GG型和I5-385 C>T的CC型可作為低開產體質量的優勢基因型,為雷州黑鴨分子標記輔助育種及建立優勢高產群體奠定了理論基礎。

3.3 雷州黑鴨EI24基因的單倍型與產蛋性能的相關性由于SNP分析只能發現保守和非保守分子功能有關的基因,而不能識別相互作用的等位基因連鎖遺傳,目前更多研究者通過群體結構和個體間差異性關聯的連鎖不平衡(LD)選育[18]。因此,本試驗使用HaploView4.2軟件對雷州黑鴨EI24基因的7個SNPs進行了連鎖不平衡分析以及使用SPSS 22.0軟件對雷州黑鴨EI24基因的7個SNPs的單倍型進行單因素方差分析,發現H1H4單倍型可作為雷州黑鴨群體篩選低開產日齡、高開產體質量和高產蛋量個體的綜合最優單倍型,為雷州黑鴨分子標記輔助育種及建立優勢高產群體提供了依據。