新疆阿勒泰部分地區雙峰駝乳房炎乳汁樣品微生物多樣性分析及主要致病菌分離鑒定

李 斌,馬萬鵬,裴文剛,鄭 瑩,段琦穎,盧亞賓,李建龍,蘇戰強

(新疆農業大學 動物醫學學院,新疆 烏魯木齊 830052)

中國是世界上雙峰駝的主要分布區域,新疆阿勒泰地區是雙峰駝的主產地之一,不完全統計數據顯示:全國約有駱駝36.87萬峰,主要分布在新疆、內蒙古、甘肅和青海,新疆存欄18.94萬峰,占全國的51.36%。從分布區域廣度上看,新疆分布最廣,且阿勒泰地區分布最為集中[1-2]。因駝奶對于人類炎癥、傷口感染[3]、肺結核[4]、糖尿病[5]等多種疾病具有治療或輔助治療的作用,且可作為優質保健營養品備受人們的青睞。近年來新疆地區乳用駱駝養殖業作為特色產業得到了迅速發展,而駱駝乳房炎的流行是制約駝奶產量提高的關鍵瓶頸[6]。

受雙峰駝分布的影響,國外研究主要以非洲地區單峰駝為主,有關哈薩克斯坦等地雙峰駝乳房炎樣品中細菌多樣性的研究尚未見文獻報道。目前新疆雙峰駝臨床型、隱型以及正常駝乳樣品中細菌菌群結構以及主要致病菌種類、耐藥情況尚未探明[7]。本研究利用Illumina MiSeq 測序技術對比分析臨床型、隱型乳房炎及正常駝乳中微生物多樣性差異,同時對采集的58份乳房炎駝乳進行細菌的分離鑒定,探究其耐藥情況,為阿勒泰地區駱駝乳房炎臨床治療及預防提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品及實驗動物所有駱駝乳樣均采自阿勒泰地區福海縣、清河縣、吉木乃縣駱駝養殖場。7周齡雌性BALB/c小鼠,購自新疆醫科大學。

1.2 主要試劑細菌生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司;科瑪嘉培養基購自杭州貝邦科技有限公司;營養肉湯培養基、瓊脂粉、血瓊脂、麥康凱培養基均購自北京奧博星生物技術有限公司;藥敏片購自OXOID公司;細菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司;Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購自TIANGEN公司。

1.3 主要儀器電子天平,德國 Sartonrius 公司;PCR儀,美國Thermo Hybaid公司;超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司;凝膠成像儀,美國Amersham Pharmacia Biotech公司;電泳槽、電泳儀,美國Bio-Rad公司。

1.4 樣品采集方法在駱駝養殖場無菌采集58份乳房炎及12份正常駱駝乳樣品,隨機挑選臨床型、隱型及正常駝乳樣品各3份,每份10 mL,干冰保存,用于細菌多樣性檢測;其余樣品置于冰盒中,36 h內送回實驗室,用于細菌分離鑒定。乳房炎樣品采用臨床癥狀(乳區紅腫、乳汁絮狀、血乳)及CMT檢查法確定。

1.5 微生物菌群多樣性檢測將上述9份乳樣,分臨床型(clinical)、隱型(subclinical)、健康(health)3組,送至派森諾生物公司進行宏基因組測序、分析。使用通用引物進行細菌16S rRNA基因V3-V4區的PCR擴增。338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCA-GCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反應條件:98℃ 2 min;98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共25個循環;72℃ 5 min。測序結果經去噪和ASV/OTU聚類后,進行生物信息學分析。

1.6 細菌分離純化與鑒定吸取1 mL乳樣加入無菌搖菌管內,加入9 mL營養肉湯培養基(含5%胎牛血清),置37℃恒溫搖床增菌培養12～16 h。增菌后無菌環境下蘸取上述培養液,分別在營養瓊脂培養基(含5%胎牛血清)、科馬嘉培養基、麥康凱培養基上劃線,培養18～24 h后挑取不同單菌落,繼續劃線,重復上述操作5次,得到純化菌株,加入甘油置于-80℃冰箱保存。純化菌株隨后進行革蘭染色,觀察其形態,結合菌落形態及培養特性,初步確定細菌種類。

隨后,根據培養特性及染色結果選擇合理的生化鑒定管,進行生化鑒定。

1.7 分子生物學鑒定使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取上述生化反應特性有差異的菌株基因組DNA,以此為模板,以27F/1492R為引物,對其16S rRNA進行擴增。PCR反應體系(20 μL):基因組DNA 1 μL,上下游引物各 1 μL,Premix Taq 10 μL,ddH2O 7 μL。反應條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 1.5 min,共35個循環;72℃ 10 min。PCR反應完成后經 1%瓊脂糖凝膠在 20×TAE 電泳液中電泳 30 min,凝膠成像系統中記錄結果。然后將PCR產物進行回收與純化,膠回收產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.8 主要致病菌致病性測定選擇分離率最高的3種細菌,首先測定菌液CFU(重復操作3次),隨后將小鼠隨機分為3組,每組5只,腹腔注射菌液0.5 mL,相同環境下飼養,小鼠自由飲食,觀察死亡情況,連續觀察7 d,用寇氏改良法計算其LD50,同時設立注射生理鹽水作為對照組。死亡小鼠解剖觀察病變情況后制作肝臟觸片,瑞氏染色觀察細菌形態。

1.9 藥敏試驗移液器吸取100 μ L上述3種菌液,無菌涂布后緊貼不同藥物紙片,37℃溫箱中培養12 h,用游標卡尺測定抑菌圈直徑,記錄。

2 結果

2.1 多樣性測序

2.1.1物種組成分析 3個樣本共得到634 492條有效序列,序列長度分布在400～440 bp之間,峰值長度為430 bp,單個樣本高質量序列在74 000～88 000之間。9個樣品共鑒定出14門、180科、210屬的微生物,選取各組平均豐度值前10細菌,繪制不同分類水平下的物種組成圖,結果表明門分類水平下Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes為主要優勢菌門,與健康乳樣相比乳房炎樣品中Proteobacteria升高,Bacteroidetes降低(圖1)。

圖1 細菌門分類水平的比較

屬水平下Aquabacterium、Acidovorax、Caulobacter、Rubrivivax、Asticcacaulis為主要優勢菌屬,通過組間分析可知臨床組和隱型組相對于健康組Aquabacterium、Asticcacaulis升高,而Acidovorax則降低,其中Aquabacterium差異較為顯著,而Caulobacter、Rubrivivax豐度的降低更有利于臨床型乳房炎的發生(圖2)。

圖2 細菌屬分類水平的比較

2.1.2Alpha多樣性分析 以組內樣品平均Chao指數,繪制稀疏曲線(圖3),3組樣品的稀疏曲線逐漸趨于平坦,表明測序量趨于飽和,且物種多樣性臨床組>隱型組>健康組。以OTU豐度排列為橫坐標,以分組中OTU的均值的對數為縱坐標繪制豐度等級曲線(圖4),曲線橫軸跨度較大,表明物種豐度較高,符合分析要求。

圖3 相似度為97%條件下各樣本的稀疏曲線

圖4 相似度為97%條件下各樣本的豐度等級曲線

物種聚類采用average聚類法,選擇豐度top 10菌屬,對分組中各物種豐度平均值進行歸一化處理后,繪制屬水平下物種組成熱圖(圖5)。結果顯示臨床型和隱型乳樣中Azospirillum、Novosphingobium、Acidovorax、Deinococcus豐度均降低,Aquabacterium、Asticcacaulis豐度升高;臨床型乳樣中Burkholderia、Ochrobactrum豐度明顯升高,Caulobacter、Rubrivivax明顯降低。

2.2 細菌分離及鑒定58份乳樣增菌經選擇及鑒別培養基純化后,革蘭染色可發現呈葡萄串排列的陽性球菌、短鏈陽性球菌、革蘭陰性桿菌(圖6),生理生化鑒定結果表明疑似葡萄球菌果糖、凝固酶、V-P等反應呈陽性(表1);短鏈陽性球菌CAMP、馬尿酸鈉、乳糖反應陽性(表2);大多革蘭陰性桿菌甲基紅、硫化氫等顯陰性(表3),分別符合金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌的反應特性。結合16S RNA測序結果表明(圖7),58份乳房炎樣品中,共分離到金黃色葡萄球菌(27株)、大腸桿菌(16株)、鏈球菌(14株)、鮑曼不動桿菌(8株)、肺炎克雷伯菌(3株)5種,68株細菌。

表1 金黃色葡萄球菌生化鑒定結果

表2 無乳鏈球菌生化鑒定結果

表3 大腸桿菌生化鑒定結果

A.金黃色葡萄球菌;B.無乳鏈球菌;C.大腸桿菌(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～24.部分菌株

2.3 主要菌株致病性測定結果經測定金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌的濃度分別為1.39×109,5.7×109,8.4×109CFU/mL,小鼠死亡情況及LD50如表4所示。腹腔注射12 h后開始出現精神萎頓,癱臥等癥狀,死亡小鼠大多發生在36～72 h之間,大多死亡小鼠剖檢可見肝、脾有水腫或壞死病變,少部分肝臟有出血點,細菌形態與接種菌一致。

表4 部分細菌引起小鼠死亡情況

2.4 藥敏試驗紙片法檢測結果顯示駝源金黃色葡萄球菌耐藥較為嚴重,已對青霉素、復方新諾明、頭孢西叮等7類藥物產生耐藥,對紅霉素、美羅培南、鏈霉素等敏感。大腸桿菌對青霉素、林可霉素耐藥,對環丙沙星、氨芐西林、鏈霉素等敏感。無乳鏈球菌對復方新諾明耐藥,對阿米卡星、鏈霉素等多數藥物敏感。

3 討論

雙峰駝雖然與單峰駝、雙峰駝、羊駝同屬駱駝科,但三者在生理功能[8]、產奶量[9]、環境適應能力以及生活環境[10-11]等方面均有所差異,而國內外關于雙峰駝乳房炎樣品中微生物菌群的研究尚未見文獻報道。張敏等[12]比較分析了新疆克州和塔城地區牛奶、駝奶、馬奶、羊奶中細菌多樣性差異,結果表明駝奶中Proteobacteria占比87.96%,與本研究健康組的85.22%較為接近,而顯著低于牛奶中的97.00%;在屬水平上,塔城地區駝乳主要以Escherichia-Shigella、Enterobacter、Lactococcus為主,而本研究健康駝乳中優勢菌屬為Aquabacterium(17.75%)、Acidovorax(20.44%)、Caulobacter(12.93%)存在顯著的差異。這種差異可能與塔城送檢駝乳被環境污染有關,一般而言Escherichia-Shigella、Enterobacter屬的微生物可能引起動物腹瀉或其他疾病,常作為致病菌被檢疫[13-14]。而本研究所涉及的乳樣已經經過乳房炎篩查且按無菌要求采集,并在采樣現場于液氮罐中保存運輸,故檢測結果更具說服力。

PIYER[15]的調查數據表明,中東地區單峰駝乳腺炎主要病原菌為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌和克雷伯菌。 ABERA等[16]研究結果表明:埃塞俄比亞索馬里州駱駝乳房、擠奶桶及市售生乳樣品中,葡萄球菌(分離率:89.8%)、鏈球菌(53.7%)、大腸桿菌(31.5%)、沙門菌(17.6%)、克雷伯菌(5.6%)和腸桿菌(5.6%)為主要致病菌。SELIGSOHN 等[17]報道:尼亞牧民駱駝乳房炎平均感染率為46 %,病原菌以無乳鏈球菌、非金葡菌葡萄球菌和金黃色葡萄球菌為主,研究結果與本研究細菌分離結果基本一致。瑪依拉等[18]在阿勒泰地區福海縣的調查結果顯示,駱駝乳房炎陽性率為26%[10],與本研究臨床型乳房炎3.8%及隱型乳房炎14.7%有較大的差異。

綜合來看,隨著新疆駝乳產業的快速發展,駱駝乳房炎仍然普遍流行,且最主要的致病菌金黃色葡萄球菌耐藥性已經較為嚴重,建議養殖企業及牧民根據藥敏結果合理用藥,同時應堅持科學養殖技術培訓,以最大限度控制乳房炎的發生。