ROS對PA誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響

曹一鳴,溫小慶,付世新

(黑龍江八一農墾大學 動物科技學院,黑龍江 大慶 163319)

圍產期由于能量攝入和輸出的不平衡導致機體處于能量負平衡狀態。能量負平衡會導致奶牛機體脂肪大量動員,引發高游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid,NEFA)血癥,而高NEFA具有脂毒性,能造成圍產期奶牛代謝紊亂、免疫抑制和繁殖障礙等,其中奶牛胎衣不下(retained fetal membranes,RFM)是與其密切相關的繁殖障礙疾病,高NEFA血癥可增加奶牛患胎衣不下的風險[1-2]。

NEFA是由油酸、棕櫚酸(palmitic acid,PA)、硬脂酸及少量花生四烯酸組成的混酸。PA是NEFA中含量最高的飽和脂肪酸,約占NEFA的34%[3],可對Saos-2細胞、BV2小膠質細胞等的增殖和凋亡造成影響,而且內質網應激和自噬也參與了PA導致的Saos-2細胞的凋亡,具有廣泛的生物學功能。

奶牛胎衣不下的發生與細胞凋亡及機體抗氧化狀態密切相關[4]。氧化應激(oxidative stress,OS)通常是由于外界不良刺激的影響下,機體先天的抗氧化防御機制被破壞,造成活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多,從而導致細胞、組織和器官的抗氧化能力下降,出現生理和病理變化[5]。研究表明PA能夠對呼吸鏈造成破壞,從而導致生物學功能紊亂引起氧化損傷,而NEFA可以使SOD、GSH-PX等抗氧化酶受到抑制,進而導致奶牛OS[6-7]。研究表明PA具有脂毒性,可以破壞細胞穩態,使細胞內的功能發生紊亂,當細胞長時間處于應激狀態時,就會導致細胞發生凋亡[8]。本試驗通過研究ROS對PA誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響,探討PA在胎衣不下發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料胎牛血清購自杭州四季青公司;青鏈霉素、胰酶、Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RPMI Medium 1640培養基購自Gibco; PA、抗氧化劑(NAC)購自Sigma;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 奶牛原代子宮內膜上皮細胞的分離培養所用的奶牛原代子宮內膜上皮細胞是使用貼壁法培養得到的,經純化后,該細胞的純度可達90%以上,完全滿足試驗所需。原代子宮內膜上皮細胞傳代至3～8代時活力最佳,所有細胞試驗所用細胞都在此范圍內。

1.3 PA及抗氧化劑(NAC)的制備取3 g牛血清白蛋白(BSA)粉末,加入10 mL超純水后,充分混勻得到30%的BSA儲備液10 mL,將其置于55℃水浴鍋中30 min后備用;將0.035 g氫氧化鉀(KOH)加入到50 mL的超純水中,充分混勻,加入0.16 g的PA,在水浴鍋中加熱到70℃,配制成12.5 mmol/L的PA;在12.5 mmol/L的PA中加入800 μL的30% BSA、1 200 μL的0.05 mmol/L HCl,充分混勻,定容為10 mmol/L PA待用。將2 g NAC粉末加入到24 mL的PBS中配制成500 mmol/L的NAC儲備液待用。

1.4 PA最適添加濃度和時間的篩選添加不同濃度的PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8和1 mmol/L)分別刺激奶牛子宮內膜上皮細胞6,12 和24 h后檢測細胞存活率,具體步驟參考CCK-8試劑盒說明。

1.5 細胞處理將培養的奶牛子宮內膜上皮細胞以2×106接種到6孔板,添加正常培養基生長24 h,當細胞生長到80%～90 %時,用新的無血清培養基取代此培養基饑餓培養12 h。對照組:用新的無血清培養基取代原先的細胞培養基,培養12 h;PA組:將原先的細胞培養基棄掉后,添加0.6 mmol/L的PA,培養12 h后收集細胞;PA+NAC組:試驗前2 h將原先的細胞培養基換成無血清培養基,加入10 mmol/L的NAC儲備液處理2 h,然后添加0.6 mmol/L的PA,培養12 h后收集細胞;NAC組:將原先的細胞培養基棄掉后加入10 mmol/L的NAC儲備液,培養12 h后收集細胞。

1.6 添加PA及NAC后上皮細胞氧化及抗氧化指標的檢測收集各組細胞,利用SOD測定試劑盒、MDA檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒檢測氧化及抗氧化指標,具體步驟參考說明書。

1.7 添加PA后上皮細胞ROS含量及細胞凋亡率的檢測收集細胞,PBS清洗2次后棄上清,每個樣品添加200 μL 的DCFH重懸,37℃避光孵育20 min后,用無血清培養基清洗2次后上機檢測ROS含量。收集細胞,PBS清洗2次后棄上清,每個樣品添加198 μL 1×Binging Buffer 重懸細胞并添加1 μL的Annexin V-FITC和1 μL的PI,設單染對照組FITC組(只標記FITC)、PI組(只標記PI)和空白組(不標記),室溫避光孵育15 min后每個樣添加300 μL PBS混勻,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 不同濃度PA對奶牛子宮內膜上皮細胞存活率的影響分別添加不同濃度的 PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)刺激奶牛子宮內膜上皮細胞不同時間(6,12,24 h),比較了PA對細胞活力的影響。如圖1所示,隨著作用時間的增加,不同濃度的PA組間差異逐漸顯著,并發現細胞活力與PA的濃度間呈濃度依賴性。當作用12 h時組間差異開始明顯,結合每組細胞活力下降的顯著性,我們選取12 h作為后續試驗的作用時間。當作用時間為12 h時,PA濃度為0.2 mmol/L時細胞活力下降不明顯,當PA濃度為0.4 mmol/L時細胞活力下降顯著(P<0.05),當PA濃度為0.6 mmol/L時細胞活力極顯著下降(P<0.01)。所以選用0.2,0.4,0.6 mmol/L這3個具有代表性的濃度進行后續試驗。

與對照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 PA對奶牛子宮內膜上皮細胞ROS含量的影響分別添加不同濃度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宮內膜上皮細胞12 h后,如圖2所示,當PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比ROS含量顯著增加(P<0.05),當PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比ROS含量極顯著增加(P<0.01)。

圖2 不同濃度PA對奶牛子宮內膜上皮細胞ROS含量的影響

2.3 PA對奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響分別添加不同濃度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宮內膜上皮細胞12 h后,如圖3所示,當PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比細胞凋亡率顯著增加(P<0.05),當PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比細胞凋亡率極顯著增加(P<0.01)。

圖3 不同濃度PA對奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響

2.4 抗氧化劑NAC對奶牛子宮內膜上皮細胞OS的影響如圖4 A所示,與對照組相比,PA組的ROS含量極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組ROS含量顯著降低(P<0.05)。如圖4 B、C所示,與對照組相比PA組的SOD活力及GSH含量極顯著下降(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組SOD活力及GSH含量極顯著增加(P<0.01)。如圖4D所示,與對照組相比PA組的MDA含量極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組MDA含量顯著下降(P<0.05)。

與PA組比較,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.5 抗氧化劑NAC對奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響如圖5所示,與對照組相比PA組的凋亡率極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

圖5 添加NAC對奶牛子宮內膜上皮細胞凋亡的影響

3 討論

研究證明,體內高水平的NEFA會對動物的卵巢和子宮都具有不同程度的損傷,高濃度的NEFA可以誘導肝細胞發生OS,并且通過激活線粒體途徑介導活化半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)從而造成肝細胞凋亡, NEFA中的PA可以通過激活NF-κB信號通路來誘導IL-8等炎性因子的表達和釋放,由此可見PA在NEFA中是至關重要的,由此我們推測PA也可以通過OS對細胞造成損傷,細胞凋亡是一種基因控制的細胞的自主性程序性死亡方式,為了證實PA誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞發生凋亡,本試驗通過CCK-8法檢測了不同濃度PA刺激不同時間的奶牛子宮內膜上皮,檢測其存活率并篩選最適濃度,同時采用Annexin V-FITC/PI雙染法證明,當PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比細胞凋亡率顯著增加,當PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比細胞凋亡率極顯著增加,結果表明隨著PA濃度的升高,細胞的凋亡率逐漸增高,呈明顯的濃度依賴關系,由此可以說明PA對奶牛子宮內膜上皮細胞存在一定程度的危害。

介導細胞凋亡的途徑有很多種,OS是其中非常重要的一種,奶牛在分娩前期胎盤的成熟至關重要,盡管成熟的胎盤能夠啟動有利的類固醇生成和花生四烯酸級聯反應,但此時抗氧化防御機制的改變會干擾細胞的類固醇生成。ROS大量積聚在胎盤,可阻止胎膜的及時分離。體內過量的ROS如果未被清除,會導致嚴重的OS反應,ROS在RFM中是非常重要的影響因素,所以本試驗通過流式細胞術檢測了ROS的含量是否會隨著PA濃度的變化而變化,當PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比ROS含量顯著增加,當PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比ROS含量極顯著增加。并且通過試劑盒檢測了SOD、MDA、GSH等氧化抗氧化指標,結果表明PA可造成細胞的OS,并導致ROS的含量升高,對細胞造成損傷。為了驗證ROS的產生是否在PA造成的細胞凋亡中起主要作用,本試驗添加了抗氧化劑NAC,并用流式細胞術檢測了ROS含量和細胞凋亡程度,結果表明添加了NAC后,細胞凋亡程度和ROS含量的上升明顯受到緩解,表明ROS對PA造成的細胞凋亡起重要的作用,由于ROS的升高會造成炎癥、內質網應激、自噬等細胞通路的激活,具體ROS是通過何種途徑導致的細胞凋亡尚不清楚。綜上所述,本試驗表明PA是NEFA中一種非常重要的酸,對細胞具有廣泛的作用,因此限制細胞內PA的水平可為酮病及胎衣不下等疾病的治療和預防提供參考。