加味揉肝湯提取物對雛雞急性肝損傷的緩解作用

王文佳,仇天新,丁金雪,王偉然,劉家國

(南京農業大學 動物醫學學院 教育部動物健康與食品安全國際合作聯合實驗室,江蘇 南京 210095)

恩諾沙星是動物專用抗菌藥,在機體內代謝為環丙沙星,能夠使體內轉氨酶水平升高,通過影響細胞色素P450酶使藥物代謝減慢[1-4],產生一定的肝毒性[5-6];恩諾沙星產生過氧化物和自由基導致氧化應激[7],降低線粒體膜電位,發生細胞凋亡[6]。人類誤食有恩諾沙星蓄積的動物源食品后,也會引起人類機體發生肝臟損傷,影響人類的生命安全。恩諾沙星在殺滅革蘭陰性菌例如大腸桿菌的同時,會使菌體破裂釋放內毒素(脂多糖),內毒素進入血液后加重肝臟負擔。有研究采用恩諾沙星聯合脂多糖新型復合式誘導肝損傷模型[8-9],為集約化動物養殖過程中肝臟疾病的防治提供了依據。

芍藥甘草湯,出自張仲景的《傷寒論》一書,由芍藥和甘草兩味中藥組成,是治療腹痛經典方劑之一[10],有調和肝脾,柔肝緩急,緩解腹痛,滋陰養血的功效。中藥具有多靶點,有研究基于網絡藥理學發現芍藥甘草湯在抗肝損傷方面有一定功效,特別是針對CYP1A2和PTGS2靶點具有診斷和治療價值[11]。加味揉肝湯是在此方劑的基礎上,遵循中醫理論增加了田基黃、厚樸、茯苓、澤瀉和五味子,按照一定比例煎煮制成。現代藥理學有研究證實,加味揉肝湯中幾味中藥具有黃酮類化合物、糖類、萜類化合物、酚類化合物以及揮發油等化學成分[12],有肝臟保護的作用。

本試驗采用LPS聯合恩諾沙星導致肝臟損傷,用來評價加味揉肝湯提取物的臨床療效,并探究藥物作用機制,以期為開發保肝藥物或動物飼料添加劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑材料LPS(L2630,Sigma);恩諾沙星(SE8390,索萊寶),純度HPLC≥98%;生理鹽水;0.1 mol/L NaOH溶液;乳酸脫氫酶LDH(BC0685,索萊寶);丙二醛檢測試劑盒(A003-4-1,南京建成);超氧化物歧化酶SOD檢測試劑盒(A001-3-2,南京建成);過氧化氫酶CAT檢測試劑盒(A007-1-1,南京建成)。

加味揉肝湯水提物(MRGD):將方劑中所有草藥200 g和2 L水加入燒杯中,浸泡45 min后,大火煮沸轉小火煮2 h。分離藥渣和藥液后,將中藥殘留物加入2 L水中進行第2次烹飪。將2次藥液混合并濃縮至200 mL,最后進行真空冷凍干燥,獲得MRGD凍干粉。

加味揉肝湯水提醇沉物/多糖(MRGDE):水提過程同上。向制備的MRGD濃縮液中添加無水乙醇至70 %的乙醇濃度。置于在4℃下沉淀,12 h后,獲得的沉淀溶解在去離子水中,并通過Sevage法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脫蛋白純化。多糖與Sevage試劑5∶1比例混合振蕩30 min后低速離心,重復3次以去除變性蛋白。最后進行真空冷凍干燥,獲得MRGDE凍干粉,凍干粉溶解在純凈水中。

1.2 動物分組及處理1日齡雛雞適應性飼養3 d后,雛雞分4組 (n=16),分為Control組,LPS-ENR組,MRGD+LPS-ENR為復方水提物組,MRGDE+LPS-ENR為復方多糖組。第4天,除Control組雛雞外,灌服恩諾沙星,連續3 d,劑量為20 mg/(kg·d)[13]。其中,第4天在灌服恩諾沙星前1 h,口服給予2種中藥干預,按中藥生藥0.075 g/(kg·d),連續處理3 d;第6天恩諾沙星處理后,雛雞腹腔注射LPS稀釋液,注射劑量為0.25 mg/(kg·d)[14-15]。Control組等體積純凈水或生理鹽水同樣處理。LPS或生理鹽水注射后,觀察雛雞一般癥狀,24 h采集血液及肝組織樣品。

1.3 肝臟表觀及組織病理學的觀察剖開雛雞腹腔,觀察肝臟是否腫脹、有無出血、壞死等現象;稱取雛雞體質量和肝臟質量,記錄數據。采用臟體系數來評價肝臟腫大情況,肝臟系數(g/g)=肝臟質量(g)/體質量(g)。用4 %多聚甲醛固定同一部位的肝組織,石蠟包埋,進行蘇木精-伊紅染色(HE),并進行病理組織學觀察。

1.4 血清生化指標測定3 000 r/min離心10 min分離并收集血清,使用生化分析儀(UniCel DxC 600 Synchron,Beckman Coulter,Brea,CA)檢測血清中AST、ALT、TP和ALB水平。

1.5 肝組織中氧化應激水平的檢測將肝組織加入到預冷的PBS中進行勻漿,檢測勻漿液中MDA的水平,以及抗氧化酶(SOD、CAT)的活性,嚴格按照生產商說明書進行試驗操作。

1.6 免疫熒光法檢測肝組織中Nrf2蛋白表達情況固定好的肝組織切片,0.01 mol/L PBS沖洗5 min,3次;除去PBS液,5% BSA室溫下封閉25 min。除去封閉液,加適量的Nrf2抗體(1∶100稀釋),4℃孵育過夜。PBS洗3遍后,避光加入山羊抗兔IgG-FITC(1∶200稀釋),37℃ 孵育45 min;棄掉二抗,加入DAPI染液,室溫15 min;PBS洗滌后,滴加防淬滅劑,封片后顯微鏡下觀察。

1.7 RT-PCR法和Western blot法檢測肝組織中抗氧化基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(R401-01,諾唯贊)提取肝組織中的RNA,使用反轉錄試劑盒(R233-01,諾唯贊)將RNA反轉為cDNA。實時熒光定量方法檢測肝組織中抗氧化基因mRNA的表達量,引物由上海捷瑞公司合成,引物序列見表1。RT-PCR的體系為10 μL,反應程序:95℃,30 s;95℃,10 s,60℃,30 s,40個循環。以GAPDH為內參,按2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

使用高效RIPA(組織/細胞)裂解液(R0010,索萊寶),提取肝組織的總蛋白,全程在冰上操作。內參選用β-actin(1∶1 000,Abclonal公司),一抗蛋白Nrf2(1∶500,Proteintech公司)和CAT(1∶500,Abclonal公司)。

2 結果

2.1 發病情況描述Control組:正常采食飲水,糞便性狀干燥偏濕,羽毛光亮。LPS-ENR組:偶有采食飲水,精神沉郁,糞便塘稀,羽毛臟亂,雞群造模后有打盹萎靡不振,扎堆,站立不穩現象。MRGD+LPS-ENR組:飲水少,糞便濕度偏干,偶有糞便發黃稀便,雞群造模后個別雞只萎靡不振;MRGDE+LPS-ENR組:飲水少,糞便形態偏干接近正常,有個別水樣糞便,雞群扎堆現象減少,個別雞只站立不穩。

由此可見采用LPS-ENR能夠造成雛雞發生腹瀉,狀態不佳,在一定程度上造成了雛雞機體損傷。

2.2 肝臟變化剖開腹腔,暴露肝臟。發現與Control組相比,LPS-ENR組雛雞肝臟腫大,有出血、瘀血,以及不同程度的壞死灶(圖1);而中藥預處理后,肝臟出血瘀血以及壞死程度均有所改善。圖2和表2結果顯示,LPS-ENR組的肝體系數顯著高于Control組(P<0.05),表明造膜后肝臟腫大;而藥物MRGD和MRGDE預處理后,藥物組的肝體系數均與Control組無顯著差異(P>0.05)。肝組織病理學觀察結果發現(圖3),LPS-ENR組的肝小葉結構不清晰,細胞核深染、碎裂,核溶解,細胞間有出血,壞死灶,炎性細胞浸潤等現象;而MRGD干預后觀察到肝組織中有輕微出血,肝小葉結構形態正常,無壞死灶,炎癥反應降低;MRGDE干預后仍有炎性細胞浸潤的現象,有輕微出血,肝小葉形態有較好的改善。

黑色箭頭表示出血、壞死

黃色箭頭表示壞死;紅色箭頭表示出血;黑色箭頭表示炎性浸潤

表2 雛雞肝體系數

2.3 對肝功能生化評價指標的影響24 h后,LPS-ENR組雛雞血清生化中AST、ALT水平較Control組有顯著的升高(P<0.05),而TP、ALB水平顯著性降低(P<0.05)(圖4)。MRGD和MRGDE藥物干預組的AST水平較LPS-ENR組有顯著降低(P<0.05),ALT水平也趨于雛雞正常組水平,但差異不顯著(P>0.05)(圖4A、B);LPS-ENR組與Control組相比TP水平有所下降(P>0.05),服用2種藥物后TP水平也趨于正常,其中MRGDE組與LPS-ENR組差異顯著(P<0.05)(圖4C);24 h后LPS-ENR組的ALB水平顯著低于Control組(P<0.05),口服MRGDE后,雛雞的ALB水平明顯被提升至正常水平,與LPS-ENR組差異顯著(P<0.05);而MRGD組的ALB水平有輕微的改善,但仍與LPS-ENR組差異不顯著(P>0.05)(圖4D)。

A.ALT;B.AST;C.TP;D.ALB

2.4 對肝組織中氧化應激水平的影響圖5所示為試驗中雛雞肝組織中氧化應激指標的變化。在造模24 h后,與Control組相比,LPS-ENR組能升高雛雞肝臟中MDA的水平(P<0.05);MRGD使MDA水平降低,較LPS-ENR組差異顯著(P<0.05),并且趨于Control組(P<0.05)(圖5A);而MRGDE的效果不顯著,MDA水平下降不明顯。

同時檢測雛雞肝組織中抗氧化酶的活性,發現LPS-ENR組肝臟中抗氧化酶SOD、CAT活性較Control組均降低(P<0.05);與模型LPS-ENR組相比,2種藥物組的抗氧化酶活性均有所改善,MRGD預處理后能有效升高雛雞肝損傷后的SOD活性(P<0.05),并能夠顯著上調CAT的活性(P<0.05);MRGDE組的SOD活性顯著高于與LPS-ENR組(P<0.05),但未升高至正常水平(圖5B),CAT的活性被改善(P<0.05)(圖5C)。

2.5 肝組織中Nrf2蛋白表達情況與Control組相比,LPS-ENR組肝臟的細胞中有少量Nrf2蛋白表達,熒光減少,熒光強度降低;MRGD和MRGDE干預后的雛雞肝臟細胞中Nrf2蛋白的表達量明顯增加,熒光增加(圖6)。表明兩種提取物的干預能夠促進雛雞肝臟組織中Nrf2蛋白表達。

2.6 對抗氧化相關基因mRNA表達水平的影響圖7結果顯示,在LPS-ENR造模后,雛雞肝臟組織中的抗氧化基因Nrf2、SOD、CAT和GPX的mRNA水平表達量較Control組均顯著降低(P<0.05)。與LPS-ENR組相比,藥物MRGD能夠顯著上調SOD和GPX的mRNA相對表達量至正常(P<0.05)(圖7C、D),并上調了Nrf2和CAT的mRNA相對表達量(P>0.05)(圖7A、B);藥物MRGDE使Nrf2和CAT的mRNA相對表達水平顯著升高并趨于正常(P<0.05)(圖7A、B),使SOD和GPX的mRNA表達水平升高,但差異不顯著(P>0.05)(圖7C、D)。

2.7 對抗氧化基因Nrf2和CAT的蛋白表達水平的影響圖8結果顯示,與Control組相比,LPS-ENR組的Nrf2和CAT蛋白相對表達量下調; MRGD組雛雞肝組織中Nrf2、CAT蛋白相對表達量較LPS-ENR組顯著增加(P<0.05),MRGDE組的蛋白相對表達量也被上調(P>0.05)。結果表明加味揉肝湯兩種提取物能夠促進肝組織中Nrf2、CAT的蛋白表達。

A.Nrf2和CAT的Western blot結果;B,C.分別為Nrf2和 CAT蛋白相對表達量

3 討論

芍藥甘草湯源于張仲景的《傷寒論》,芍藥與甘草等量,臨床上用于腹痛,現代研究發現其有鎮痛、抗氧化等功效,本試驗以芍藥甘草湯為基礎方,添加田基黃、五味子等中藥組成的加味揉肝湯。水提法和水提醇沉法在臨床實踐中極為常見,也是規模化和商業化的草藥加工方法。水提法也是最經典、最古老、最簡單的草藥制備方法,而水提醇沉法獲得的多糖是草藥中含量豐富的一種活性成分,它也被證明具有廣泛的功能。因此,本試驗借鑒現代醫學的研究、藥物本身的性質特點以及中醫用藥理論,評價了2種產物對肝臟的影響,期望對今后藥物和飼料添加劑的開發有生產實踐的指導意義。試驗發現加味揉肝湯水提物(MRGD)和多糖提取物(MRGDE)對脂多糖聯合恩諾沙星(LPS-ENR)導致的雛雞肝臟損傷有保護作用,能降低雛雞血清AST、ALT的水平,升高TP、ALB水平,對損傷的肝臟病理結構有一定的改善,降低肝臟腫脹程度,減少肝臟出血和壞死等,提示該方劑的兩種提取物干預對肝損傷雛雞有一定的保護作用。

有研究證實,恩諾沙星被過量或不恰當的使用會產生一定的肝毒性,危害機體的健康。恩諾沙星是動物專用抗生素用以防治細菌病的感染,在殺菌的同時造成細菌破裂釋放脂多糖。脂多糖是細菌的細胞壁成分,能激活NF-κB信號通路,激活炎性因子的表達,釋放NO、自由基等物質攻擊細胞[16-17],導致機體發生炎癥和氧化應激反應[16]。Nrf2是保護細胞免受氧化損傷的關鍵轉錄因子,當細胞發生氧化應激作用后,胞漿中的Keap1發生修飾后,其與Nrf2發生解離,Nrf2被釋放后并進入細胞核與抗氧化原件(ARE)結合,從而調控編碼抗氧化蛋白的上游區域[18]。Nrf2通路被激活后,調控NQO1等下游靶蛋白,促進CAT、SOD和GPX等下游蛋白的表達[19]。本試驗發現,過氧化氫酶(CAT)的活性隨著肝臟損傷也隨之降低,CAT能夠清除體內的H2O2,使細胞免受H2O2造成的氧化損傷[20]。由于脂多糖和恩諾沙星的使用,雛雞體內的自由基過量堆積,消耗大量的CAT,使機體中CAT的含量降低。當自由基大量增加,CAT和SOD就不足以清除自由基,導致機體發生氧化損傷。而加味揉肝湯水提物和多糖成分可不同程度地提高抗氧化酶SOD和CAT的活性,降低氧化損傷評價指標MDA的水平,并且使受損傷肝臟中的Nrf2蛋白表達升高,提升Nrf2通路的抗氧化相關基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平。綜上,加味揉肝湯水提物和其多糖提取物的干預通過激活Nrf2通路來提高機體的抗氧化能力,降低肝臟氧化應激程度,從而改善LPS-ENR導致的雛雞肝損傷。但2種提取物的保護效果無明顯差異,考慮到經濟成本、藥物作用效果、繁瑣工藝等方面,需參照實際情況,是否進一步進行中藥的提取加工,在畜禽養殖過程中具有理論指導意義。