fimH基因敲除對大腸桿菌NMGCF-19菌株致病性的影響

楊茗崴,王瑋玉,王裕光,胡俊英,張 群,張芷源,王新平

(吉林大學 動物醫學學院 人與動物共患傳染病國家重點實驗室/教育部人獸共患病研究重點實驗室,吉林 長春 130062)

大腸桿菌是一種廣泛存在于人與動物體內的機會性致病菌,可引起人與動物發生多類型表現的傳染病,如敗血癥、腸炎、尿道炎、菌血癥、肺炎和腦膜腦炎等。本實驗室前期從臨床上呈現嚴重腹瀉和神經癥狀為特征的羔羊體內分離獲得1株大腸桿菌NMGCF-19菌株,發現NMGCF-19菌株可以通過血腦屏障,引起動物腦膜腦炎[1]。

大腸桿菌具有許多與感染相關的毒力因子,如P型菌毛、Ⅰ型菌毛、溶血素、細胞壞死因子等,這些毒力因子在細胞黏附、損傷宿主細胞及環境生存等方面發揮作用。其中菌毛是大腸桿菌介導菌體黏附在宿主細胞上的一種重要的黏附因子[2],借助于菌毛對宿主黏膜上皮細胞的黏附作用,細菌得以定居,以便進一步獲得侵入血液,進入器官的通道,并且有研究發現菌毛在許多腸外致病性大腸桿菌的致病機制中發揮著關鍵作用[3],由此我們推斷菌毛與大腸桿菌NMGCF-19菌株突破血腦屏障引起動物腦膜腦炎等致病能力有關。菌毛中Ⅰ型菌毛起主要黏附作用,該菌毛能與宿主黏膜上皮細胞上的甘露糖受體發生特異性結合,從而導致細菌黏附在黏膜上皮細胞上,同時95%大腸桿菌表達Ⅰ型菌毛,而P型菌毛則是對疾病的進一步發展起重要作用[4-5]。Ⅰ型菌毛與大腸桿菌的致病性密切相關,其fimH蛋白與Ⅰ型菌毛的黏附及免疫反應緊密相關,有研究顯示fimH基因廣泛存在于大腸桿菌,因此本試驗將fimH基因作為靶向敲除基因[4-6]。

目前廣泛應用于大腸桿菌基因敲除的方法有lambda Red重組系統和自殺質粒介導的同源重組基因敲除方法,但前者在同一個細菌引入多個突變的條件下,每引入一個突變就會影響下一個突變的成功率,還可能造成非所需突變的產生,甚至還會引起細菌基因組的不穩定;后者對某些保守且敲除困難的基因篩選效率極低,進而限制其應用。由于以上兩種方法的限制性,本研究選擇應用基因編輯效率高的CRISPR/Cas9基因編輯技術來完成基因敲除的操作。進行基因編輯操作時,CRISPR/Cas9系統需要轉錄兩個RNA片段,一個是前體CRISPR(pre-crRNA),另一個是轉錄激活RNA(tracrRNA)[6-9]。這兩個RNA通過堿基配對形成二聚體,與Cas9蛋白結合,形成復合物;然后,在pre-crRNA的介導下發揮Cas9蛋白的HNH與RuvC活性,切割基因組特定位置的DNA,形成DNA雙鏈斷裂[10-23]。JINEK等[24]將pre-crRNA和tracrRNA加工成一條單鏈RNA嵌合體,稱之為gRNA。CRISPR/Cas9中的gRNA 3′端還有一段小的前間區序列鄰近基序(PAM),目前證明PAM一般為NGG,是CRISPR/Cas9系統的必備區域[8]。為了進一步探索NMGCF-19菌株的致病機制,本研究將應用CRISPR/Cas9技術和小鼠模型,通過敲除菌株潛在毒力基因fimH及確定其致病性,為闡明NMGCF-19菌株的致病機理奠定基礎。

A.pwtCas9-fimH-sgRNA1;B.pwtCas9-fimH-sgRNA3

A.NMGCF-19wild在Amp培養皿上的培養結果;B.pwtCas9-N19-fimH-sgRNA1質粒轉化結果;C.pwtCas9-N19-fimH-sgRNA3質粒轉化結果;D.空白Amp培養皿用作陰性對照

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、培養基和抗生素大腸桿菌NMGCF-19菌株分離于臨床上呈現嚴重腹瀉和神經癥狀的羔羊[1-2],由吉林大學動物檢驗檢疫教研室保存;pwtCas9-fimH-sgRNA1、pwtCas9-fimH-sgRNA3質粒均由吉林大學動物檢驗檢疫教研室成功構建并保存;培養基為LB培養基;抗生素為終質量濃度100 mg/L的氨芐青霉素。

1.2 主要試劑Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Bbs Ⅰ和氨芐青霉素均購自美國 Thermo Fisher Scientific公司;HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;細菌生化檢測試劑盒購自杭州微生物試劑有限公司;膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒及質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 實驗動物24只SPF級昆明小鼠(6～7周齡),雌雄各半,購自遼寧長生生物科技有限公司;小鼠飼養條件良好,自由采食及飲水,飼養過程中的晝夜明暗循環為12 h,室溫控制在(22±0.5)℃之間。

1.4 NMGCF-19fimH-的構建利用本實驗室前期測定的NMGCF-19菌株完整基因組序列,獲得fimH基因的序列信息,進行sgRNA的設計,在其5′端分別加上Bbs Ⅰ酶切位點的黏性末端(CACC/AAAC),得到Cas9-fimH-F和Cas9-fimH-R引物,送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如表1所示。將Cas9-fimH-F、Cas9-fimH-R 稀釋至100 μmol/L,經退火形成具有黏性末端雙鏈DNA。反應體系Cas9-fimH-F 和Cas9-fimH-R 各10 μL,反應程序94 ℃ 5 min,然后以 0.1℃/s 降溫至 4℃。取PCR擴增產物,進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將pX459質粒以Bbs Ⅰ限制性內切酶進行酶切處理,經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,將膠回收產物與退火后形成的雙鏈sgRNA(DNA)進行連接,以構建好的載體轉化大腸埃希菌Top10感受態細胞,使用質粒提取試劑盒將質粒提出,經PCR及測序驗證后獲得pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體。

表1 敲除載體引物序列

大腸桿菌NMGCF-19菌株電轉感受態細胞的制備,參見文獻介紹方法進行[25]。各取1 μL純化后的pwtCas9-fimH-sgRNA1、pwtCas9-fimH-sgRNA3基因敲除載體于1.5 mL離心管中,并將其與電轉杯一同置于冰上預冷,向離心管內各加入40 μL解凍的NMGCF-19電轉感受態細胞,混勻后冰上放置10 min;將該混合物轉移至電轉杯中,電轉儀電壓調節為2.1 kV進行電轉操作。

取20 μL轉化產物加160 μL LB,混勻后涂布于含有終質量濃度為100 mg/L氨芐青霉素的固體平板,37℃過夜培養后挑取單克隆搖菌,使用購自天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組提取試劑盒提取菌液中的細菌基因組,用針對fimH基因的特異性引物fimH-up和fimH-dn進行PCR檢測。對PCR檢測成功的細菌,回收其PCR產物進行TA克隆,并送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序;將測序結果和原基因序列進行比對,檢測fimH基因是否敲除成功,檢測成功則獲得NMGCF-19fimH-。

1.5 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild生物學特性的鑒定以比濁法測定并繪制生長曲線。取NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-各接種于10管3 mL LB液體培養基中,于接種后 0,2,3,4,6,8,10,12,22,24 h 分別收取1管菌液,保存于4℃冰箱內。待收集齊所有菌液后,同時測定吸光度值(D600 nm),并以GraphPad Prism 9.0軟件繪制NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-的生長曲線。

以接種環取適量NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-,接種于各生化鑒定管(半固體培養基、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、蛋白胨水、甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇、棉子糖、MR-VP)中,用封口膜封住,37℃培養箱中培養48 h,培養后觀察并記錄各鑒定管的變化。

1.6 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild致病性的確定將24只小鼠隨機分為4組,分別為NMGCF-19菌株接種組、NMGCF-19-F1菌株接種組、NMGCF-19-F3菌株接種組和正常對照組,每組6只,每組小鼠分別腹腔注射濃度為106CFU/0.1 mL的各菌株菌液(N-19、F1、F3)0.1 mL(即NMGCF-19wild的LD50值[3])或同體積生理鹽水,接種后觀察記錄小鼠的活動狀態與存活情況,并用GraphPad Prism 9.0軟件繪制小鼠的生存曲線。對死亡或發病小鼠進行剖解,取小鼠肝臟、腎臟、肺臟等器官組織,用福爾馬林固定后制作石蠟切片,進行 HE染色與病理組織學變化觀察。同時,取小鼠腦組織進行涂片、革蘭染色鏡檢并提取腦組織總RNA后反轉錄合成cDNA,用于腦組織中緊密連接蛋白的實時熒光定量PCR檢測。緊密連接結構蛋白基因的引物根據 GenBank 上傳的序列設計,各基因擴增的長度為 100 bp 左右,引物名稱和序列如表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體的構建將設計的sgRNA引物經退火處理后與Bbs Ⅰ內切酶酶切的pX459質粒產物連接,連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞,提取質粒經PCR驗證陽性后進行基因測序鑒定。結果如圖1所示,所構建的3種pwtCas9-fimH-sgRNA 基因敲除載體中只有pwtCas9-fimH-sgRNA1和pwtCas9-fimH-sgRNA3載體測序結果正確,構建成功率為66.7%。

2.2fimH基因轉化效率驗證將成功構建的pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體通過電穿孔轉化到NMGCF-19菌株感受態細胞中,并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板,12 h后的培養結果如圖2所示。挑取單克隆搖菌后提取細菌基因組,PCR擴增片段測序確定fimH基因敲除,表明成功構建了NMGCF-19fimH-。

2.3 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的生長速率無顯著性差異比濁法測定并繪制的NMGCF-19wild及NMGCF-19fimH-生長曲線如圖3所示。F1基因敲除株生長速率與NMGCF-19wild基本相同,而F3基因敲除株生長速率與NMGCF-19wild相比略有降低。

圖3 NMGCF-19wild與fimH-sgRNA1(F1)和fimH-sgRNA3(F3)基因敲除菌株的細菌生長曲線

2.4 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的生化特性鑒定無顯著性差異接種NMGCF-19fimH-(F1和F3)與NMGCF-19wild的生化鑒定管觀察后結果記錄如表3所示。NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild相比,只有在對鳥氨酸脫羧酶的利用上存在差異,鑒定結果NMGCF-19wild呈陰性,而NMGCF-19fimH-呈陽性。

表3 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild生化特性鑒定結果

2.5 NMGCF-19fimH-的LD50值高于NMGCF-19wild將1.0×106CFU(即NMGCF-19wild的LD50值[1-2])的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,觀察小鼠的活動狀態及存活情況,記錄結果如圖4所示。所有腹腔注射NMGCF-19wild和fimH3基因敲除株的小鼠均在24 h內死亡,但在12 h時NMGCF-19wild感染的小鼠死亡4只,fimH3基因敲株感染小鼠死亡2只,而fimH1基因敲除株感染的小鼠有4只超過48 h仍存活。結果表明:NMGCF-19fimH-的LD50值與NMGCF-19wild相比明顯增大。

圖4 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的小鼠死亡曲線

2.6 NMGCF-19fimH-感染小鼠腦組織中菌體數量明顯少于NMGCF-19wild將1.0×106CFU的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,24 h 后對腦組織進行涂片,革蘭染色后鏡下觀察結果如圖5所示。NMGCF-19fimH-感染的小鼠腦組織中未見有或僅見有少量菌體,而NMGCF-19wild感染小鼠腦組織見有大量的細菌,表明fimH基因敲除后能夠通過小鼠血腦屏障的菌體數量顯著減少。

A.NMGCF-19wild感染;B.fimH1基因敲除株感染;C.fimH3基因敲除株感染;D.注射同體積生理鹽水用作陰性對照

2.7 NMGCF-19fimH-感染小鼠器官組織的病理變化明顯輕于NMGCF-19wild將1.0×106CFU的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,經24 h相同條件飼養后剖解小鼠,取其肝臟、腎臟、肺臟組織作石蠟切片,HE染色后鏡下觀察結果如圖6所示。NMGCF-19fimH-感染引起的小鼠器官組織DIC、炎性浸潤和組織細胞變性腫脹等病理變化程度與NMGCF-19wild相比明顯減輕。

A,B,C.注射同體積生理鹽水(正常健康狀態)用作陰性對照的小鼠肝臟、腎臟、肺臟組織;D,E,F.分別為NMGCF-19wild感染小鼠的肝臟、腎臟、肺臟組織;G,H,I.NMGCF-19fimH-感染小鼠的肝臟、腎臟、肺臟組織

2.8 NMGCF-19fimH-感染對小鼠血腦屏障的破壞程度小于NMGCF-19wild本實驗室前期研究發現大腸桿菌NMGCF-19菌株具有破壞動物血腦屏障而侵入腦組織的致病能力。為確定fimH基因敲除對腦組織血腦屏障的影響,運用qPCR方法檢測小鼠腦組織中緊密連接蛋白的表達量。結果如圖7所示,NMGCF-19fimH-(F1和F3)感染小鼠腦組織中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在核酸水平上的表達量與NMGCF-19wild相比顯著上調,表明NMGCF-19fimH-對小鼠血腦屏障的破壞程度明顯小于NMGCF-19wild。

圖7 qPCR檢測NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild感染小鼠腦組織中ZO-1和Occludin核酸表達量

3 討論

NMGCF-19菌株作為2019年本實驗室從羔羊體內分離出的一種腸外致病性大腸桿菌[1-2],可引起動物諸多嚴重典型的組織器官病變,因此對其毒力因子和致病機制的研究具有重要意義。本實驗室在前期已完成對該菌株的分離鑒定和全基因組的測序,并確定了NMGCF-19菌株具有突破動物血腦屏障進而引起腦膜腦炎的致病能力。本研究為了進一步探索NMGCF-19菌株的毒力基因及其初步致病機制,通過敲除某一潛在毒力基因和比較其與NMGCF-19wild對小鼠的致病性差異,確定基因的毒力。由于菌株的fimH基因蛋白與細菌Ⅰ型菌毛的黏附及免疫反應密切相關,并且我國目前對于大腸桿菌Ⅰ型菌毛的研究相對較少,因此我們選擇fimH基因作為本試驗所敲除的潛在毒力基因。由于目前常用基因敲除方法的自身局限性,我們轉向選擇CRISPR/Cas9基因編輯系統來進行基因敲除的操作。

通過設計sgRNA引物、退火、酶切、連接、轉化、PCR及測序驗證等方法,成功構建了pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體;將該載體電轉NMGCF-19感受態細胞后,經驗證成功構建了NMGCF-19fimH-。將NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild進行比較之后發現NMGCF-19fimH-具有與NMGCF-19wild不同的可以利用鳥氨酸脫羧酶的生物學特性,而細菌鳥氨酸脫羧酶在細菌生長、環境適應、抗生素抗性、生物膜形成等方面起到調節作用[26-29];在致病性方面,發現與NMGCF-19wild相比,NMGCF-19fimH-的LD50值更大,所引起動物組織器官病變的程度更弱,對動物血腦屏障的破壞性更小并且進入腦組織的菌體數量更少,這些結果表明,fimH基因的敲除可以在一定程度上降低NMGCF-19菌株的致病能力,即fimH基因為NMGCF-19菌株的毒力基因之一。

本研究確定了fimH基因為大腸桿菌NMGCF-19菌株的毒力基因之一,并為進一步闡明該菌株的致病機制和臨床診療提供理論依據。