河南地區青年鵝源細小病毒分離鑒定和全基因組序列分析

張曉戰,邢忠玉,陳夢云,陳家霖,董 青,湯宇心,王子玥,趙利嬌,江 澳,徐志坤,彭志鋒,邊傳周,袁 野

(1.河南牧業經濟學院 動物醫藥學院,河南 鄭州 450046;2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠,河南 鄭州 450048)

鵝細小病毒感染又稱為小鵝瘟(goose plague,GP),是由鵝細小病毒(goose parvovirus,GPV)引起的雛水禽的一種急性、致死性、高度接觸性傳染病[1-2]。GPV是一種無囊膜的單鏈DNA病毒,基因組長度約5.1 kb,與番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)和新型鵝細小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)一樣,屬于細小病毒科(Parvovidae)依賴性細小病毒屬(Dependoparvovirus)[3]。GPV基因組包含2個開放閱讀框(open reading frame,ORF),ORF兩端含有細小病毒科典型的重復倒置回文結構(inverted terminal repeats,ITRs)[4]。基因組左側ORF編碼兩種非結構蛋白NS1和NS2,在病毒復制、轉錄和翻譯等感染過程及調控宿主的細胞凋亡和細胞周期方面具有重要作用[5];基因組右側ORF編碼3種結構蛋白VP1、VP2和VP3,3者羧基端蛋白序列相同,共同組成病毒粒子,是病毒重要的毒力相關蛋白,其中VP3為主要的衣殼蛋白,是主要的保護性抗原蛋白,可以刺激機體產生中和抗體[2,6]。

GPV主要感染3周齡以內雛鵝和雛番鴨,尤其是導致雛鵝的發病,發病率和病死率可達100%。該病病程可表現為急性感染和亞急性感染,臨床上以嚴重下痢和滲出性腸炎為主要特征,剖檢可見小腸腸腔內含香腸狀凝固性栓子[1]。該病呈世界性分布,1956年,GPV感染引發GP疫情在江蘇揚州等地鵝群發生流行,方定一[7]教授首次報道描述了GP的發生;相同時期,法國、荷蘭、波蘭、匈牙利等多個國家地區的鵝群相繼暴發相似的疫病,給世界養鵝業造成了巨大的經濟損失[1-2]。隨后,多個國家研制及推廣應用小鵝瘟疫苗和卵黃抗體等生物制品,該病在世界范圍內得到較好的控制。近年來,隨著GPV病原的變異和跨物種感染鴨群現象的出現[8-9],GP的流行態勢發生了新的變化,目前在我國廣東、江蘇、福建、河南、山東等地區鵝養殖密集呈無規律散發流行,嚴重危害我國水禽養殖業健康可持續發展。

2020年6月,河南開封地區某鵝養殖場發生疑似GP疫情,雛鵝群和青年鵝群出現了不同程度的死亡。本研究以該鵝場發病死亡的青年鵝為研究對象,通過病鵝臨床表現和病理剖檢變化,結合病原分子生物學診斷,確定該鵝場青年鵝群中零星死亡的發病原因,并進一步通過病原分離鑒定和全基因組序列測序,對發病鵝場GPV流行毒株的基因特征進行分析,為下一步該病的科學防控提供合理科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2020年6月中旬,河南開封某鵝場雛鵝群和青年鵝群相繼發病。通過與養殖戶溝通,了解該鵝場當前存欄23日齡雛鵝約4 100只,55日齡青年鵝存欄約2 300只,雛鵝和青年鵝處于混養狀態。雛鵝群在6月初開始發病,發病率30%左右,死亡約700只。病鵝表現食欲減退,精神萎靡,排青綠色稀糞,死前倒地抽搐,表現明顯神經癥狀。雛鵝群有GP卵黃抗體、抗生素藥物和抗病毒中藥藥物使用史,療效較好,病程約1周。雛鵝群發病后10 d,部分青年鵝開始出現精神萎靡、拉稀、突然倒地死亡。隨機挑選3只病死青年鵝進行解剖,無菌采集部分病鵝肝臟、脾臟和小腸等組織進行實驗室診斷。

1.2 主要試劑病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;反轉錄試劑盒ReverTra Ace?購自東洋紡生物公司;2×SanTaq PCR Mix預混液、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL2000 DNA Marker、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司;感受態細胞TOP10由本實驗室保存。

1.3 引物的設計及合成在病原實驗室診斷過程中,GPV、鵝星狀病毒(goose astrovirus,GAstV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus-1,APMV-1)和禽呼腸孤病毒(goose reovirus,GRV)病原檢測所用的引物均來自針對基因組中保守的區域,部分引物的設計參考已發表的文獻,引物具體信息見表1。所用引物均由河南尚亞生物技術有限公司合成。

表1 引物序列及相關信息

1.4 可疑病原的核酸檢測

1.4.1病料的處理 取采集的病鵝肝臟、脾臟和小腸組織約0.5 g,剪碎后用含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素無菌生理鹽水制成1∶4的懸液,研磨勻漿后反復凍融3次,8 000 r/min離心5 min,上清用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌,分裝凍存至-80℃備用。

1.4.2病原核酸的提取 按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒操作說明提取上清樣品的DNA/RNA,洗脫獲得的樣品DNA/RNA混合物。取部分核酸混合物,通過ReverTra Ace?反轉錄試劑盒,利用隨機引物進行反轉錄反應,反應總體系為40 μL。反轉錄獲得cDNA樣品和剩余的DNA樣品分別凍存至-20℃備用。

1.4.2病原的PCR鑒定 以臨床樣品的DNA混合物為模板進行PCR擴增檢測GPV,cDNA混合物為模板進行PCR擴增檢測GAstV、AIV、APMV-1和GRV。PCR擴增體系25 μL,其中2×SanTaq PCR Mix預混液(含DNA聚合酶、dNTP和反應緩沖液)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板1.5 μL,ddH2O 10.5 μL。參照文獻[10-12],應用降落PCR(touch-down PCR,TD-PCR)反應程序進行PCR擴增,所獲得的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病毒的分離鑒定將1.4中經核酸鑒定為陽性樣品的過濾上清,接種12日齡健康鵝胚5枚,200 μL/胚,石蠟封孔后置于37℃溫箱孵育,同時設置2枚鵝胚為對照組。逐日觀察鵝胚健康狀況,棄掉24 h內死亡鵝胚,收集接毒后7 d內死亡鵝胚尿囊液,剖檢死亡鵝胚,觀察記錄病變情況。將病毒在健康鵝胚上連續傳代3次,收集死亡鵝胚尿囊液,離心后取上清凍存至-80℃備用。

為鑒定分離到的病原是否單一,用試劑盒提取第3代鵝胚尿囊液病毒核酸,參照1.4.2的步驟進行常見鵝病原的檢測,確定GPV分離物中是否存在其他病原的污染。此外,參照文獻[13],取第3代分離尿囊液上清,經PEG 6000濃縮后制成待檢抗原,進行瓊脂凝膠免疫擴散試驗,驗證其與GP陽性血清和陰性血清的反應性。

1.6 GPV全基因組測序參照GenBank中已經發表的GPV中國流行株核酸序列,設計引物,用于擴增GPV/HNKF-2020株全基因組,引物具體信息見表2。將1.5中經核酸鑒定為陽性樣品通過重疊PCR技術對GPV全基因組進行克隆測序。利用高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase,分別以7對引物進行PCR擴增,擴增產物經核酸電泳鑒定后,利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收產物連接至TOPO-Blunt克隆載體,轉化TOP10感受態細胞,分別利用克隆引物鑒定陽性菌落,陽性菌落擴繁后提取質粒,送至河南尚亞生物技術有限公司進行測序。

表2 GPV基因組擴增引物序列及相關信息

1.7 GPV全基因組序列分析通過檢索GenBank數據庫中近年來國內外公開的鵝源GPV毒株和其他水禽源GPV毒株代表毒株序列,進行BLAST對比分析,利用DNAStar軟件中的MegAlign程序分別比對所鑒定毒株全基因組與其他GPV毒株之間的相似性。將所分析毒株的全基因組序列和其編碼的病毒蛋白氨基酸序列提交Clustal Omega進行在線比對[14],分析比對所分離GPV毒株的全基因組和各病毒蛋白突變情況,并進一步通過MEGA 7.0程序繪制進化樹[15],分析本次發病鵝場GPV毒株的遺傳演化情況。

2 結果

2.1 病例綜合診斷發病鵝場病鵝群55日齡左右,與雛鵝混養,雛鵝有疑似GP發病史。病鵝表現精神萎靡、拉稀、突然倒地死亡。對3羽病死青年鵝進行病理解剖,可觀察到病鵝小腸段存在腫脹,黏液較多,部分腸道膨大,形似香腸狀,內含纖維素性滲出物和壞死物凝固而成的凝栓物(圖1A,B)。采集病鵝病料組織,進行可疑病原的核酸檢測,通過TD-PCR后,各個病原的檢測PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,發現病死鵝病料組織中均檢測出GPV核酸(3/3),部分病鵝同時檢測出GAstV(1/3),AIV、APMV-1和GRV的核酸檢測陰性(圖1C),初步鑒定該發病鵝場存在GPV感染。

A.腸道內纖維素性滲出物;B.腸道內壞死物凝固成的栓子;C.相關病原核酸PCR/RT-PCR檢測結果

2.2 GPV分離鑒定將鑒定為GPV陽性的病料組織處理后,接種12日齡鵝胚,第1代接種后5 d 死亡2枚。取死亡鵝胚尿囊液檢測確定GPV陽性后,繼續在鵝胚傳代至第3代,能夠導致4枚鵝胚接種后7 d內死亡。死亡鵝胚胚體出血嚴重(圖2 A)。收集死亡鵝胚尿囊液進行AGP試驗,結果顯示GPV陽性鵝胚尿囊液與GPV陽性血清發生特異性反應,兩孔之間可見明顯沉淀線。與GPV陰性血清及各組生理鹽水對照不發生反應,孔間無沉淀線(圖2B)。提取尿囊液核酸,PCR擴增出GPV目的大小核酸片段,顯示GPV陽性(圖2C),未擴增其他病原的核酸片段。以上結果表明成功分離到1株青年鵝源GPV,結合該病例發生時間和地點等信息,命名該毒株為GPV/HNKF-2020株。

A.接種GPV后導致鵝胚胚體出血;B.GPV瓊脂擴散試驗陽性;C.接種GPV尿囊液PCR陽性

2.3 GPV/HNKF-2020株全基因組序列分析以重疊PCR方法利用7對特異性引物對GPV分離株全基因序列進行PCR克隆。經過對克隆產物的測序驗證和序列拼接,確定青年鵝源GPV分離株GPV/HNKF-2020株基因組長度為5 045 bp。基因組兩端含有細小病毒科典型的ITRs,長度為415 bp,其中1～167 bp和212～378 bp序列嚴格反向互補。基因組含有2個ORF框,其中編碼非結構蛋白的NS基因長度為1 884 bp (509～2 392 bp),編碼結構蛋白的VP基因長度為2 119 bp (2 411～4 609 bp)。與經典GPV毒株Virulent B株和疫苗株SYG61v株ITRs序列相比,GPV/HNKF-2020株在70～83 bp和280～293 bp間存在2段14 bp基因缺失。最近在鴨群頻繁發生的NDRV毒株JS1603、QH15和SD等株,在58～71 bp和331～344 bp間存在2段14 bp基因缺失(圖3)。

圖3 GPV/HNKF-2020株ITRs區域序列分析

通過NCBI數據庫在線BLAST分析GPV/HNKF-2020株與GenBank數據庫已有的GPV毒株相似性,發現GPV/HNKF-2020株與2016年安徽地區分離的鵝源GPV強毒株DY16株相似性較高[16]。下載GenBank數據庫中鵝源GPV毒株和其他禽源GPV代表毒株序列,與GPV/HNKF-2020分離株進行序列比對,結果顯示,GPV/HNKF-2020株與DY16株、2016年重慶地區分離的鵝源RC16株[17]和2019年河北地區鴕鳥源HB-2019株[18]序列相似性高,達99.5%左右;與近年來鴨群中頻繁發生的NGPV毒株(JSJS1603株、QH15株和SD株)序列相似性為95%左右。此外,GPV/HNKF-2020株與疫苗株SYG61v和經典GPV毒株GDaGPV核苷酸相似性較低,為93%左右。

2.4 GPV/HNKF-2020株遺傳演化分析為了解分離GPV毒株的遺傳進化情況,分別基于全基因組和主要結構蛋白VP3實施多序列比對,利用MEGA 7.0程序繪制進化樹進行分析。基于全基因組核苷酸序列的遺傳演化分析結果顯示GPV/HNKF-2020株和DY16株、RC16株和HB-2019(鴕鳥源)株親緣關系較近,演化關系上屬于同一分支,為DY-16 like毒株。該分支毒株與分離自天鵝(SHFX1201株)、雁鵝(Yan-2株)、鴻雁(FJ01株)和灰雁(Virulent B株)等禽類的GPV毒株,及疫苗株SYG61v、VG32/1和82-0321V等均歸類于經典的GPV類群,但存在一定的遺傳距離。GPV/HNKF-2020株與近年來流行在麻鴨、櫻桃谷鴨群流行的NGPV毒株和MDPV毒株遺傳距離較大,親緣關系較遠(圖4)。此外,基于VP3蛋白氨基酸序列的遺傳演化分析結果與全基因組結果相似,顯示與GPV/HNKF-2020株親緣關系最近的DY-16 like分支的毒株,且主要為2016年以來國內鵝群分離毒株(圖5)。此外,GPV/HNKF-2020株與疫苗株SYG61v在VP3基因上親緣關系較近,與VG32/1和82-0321V等疫苗株具有一定的遺傳距離,親緣關系較遠。

圖4 GPV/HNKF-2020株全基因組演化分析

圖5 GPV/HNKF-2020株VP3基因遺傳演化分析

2.6 GPV/HNKF-2020基因組序列突變情況分析為進一步分析發病鵝場GPV毒株特性,通過全基因組和各病毒蛋白序列比對,分析GPV/HNKF-2020株與其他GPV毒株、NGPV毒株和MDPV毒株間堿基和氨基酸突變情況。結果顯示,GPV/HNKF-2020株基因組含有C478T、C769T、G942A、G1867A、C4459G、C4516T和A4611T等7個特有的堿基突變位點,其中5個堿基突變位于基因組ORF區域,4個堿基突變為同義突變,G942A突變導致非結構蛋白NS1發生R145K氨基酸突變。進一步分析發現,近年來在鵝群流行的DY-16 like分支毒株在結構蛋白VP1發生V554I的突變,該位點定位于病毒主要衣殼蛋白VP3抗原表位密集區。

3 討論

我國是水禽養殖和消費大國,水禽產業是我們國家畜牧業和農業經濟的重要組成部分,是我國的特色型產業。根據國家水禽產業體系統計的數據,2020年我國水禽養殖數量非常龐大,國內22個水禽主產區肉鴨出欄46.83億只,蛋鴨存欄1.46億只,鴨蛋產量284.66萬t,肉鵝出欄約6.39億只。水禽養殖業在我國養殖模式多元,不同地區的水禽養殖業存在水養、旱養和籠養等多種模式[19]。總體來講,國內水禽飼養設施相對比較落后,養殖場生物安全防護能力較弱,抵御疫病能力較差。尤其是近幾年非洲豬瘟疫情暴發以來,水禽產業養殖規模盲目擴張,養殖總量逐年遞增,粗放的養殖管理模式,不斷加大的養殖密度,進一步加劇新發和再發水禽疫病的發生[20]。

水禽細小病毒病是一種危害嚴重的水禽病毒性傳染病,包含GPV感染雛鵝和雛番鴨引起的GP,MDPV感染雛番鴨引起的番鴨“三周病”,及NGPV感染肉鴨和麻鴨引起的短喙侏儒綜合征[3]。近年來隨著病原的變異,該病的流行態勢發生了新的變化。GPV在河南、山東、安徽、江蘇、廣東、浙江等多個鵝養殖密集區存在暴發流行,能夠跨物種感染導致天鵝、鴕鳥、雁鵝等禽類發病[18,21-22]。本研究鑒定的GPV/HNKF-2020株,其遺傳演化關系與近幾年國內鴕鳥(HB-2019株)、天鵝(SHFX1201株)、雁鵝(Yan-2株)、鴻雁(FJ01株)等特禽類感染的GPV株親緣關系近,演化關系上屬于同一分支,說明國內GPV流行毒株基因組和保護性抗原VP3沒有發生較大的變異,暗示一些在鵝群應用效果良好的疫苗株可在特禽GPV防控過程中發揮一定的作用。此外,自2015年,由GPV變異形成的NGPV感染櫻桃谷鴨和麻鴨的現象日益增多。LI等[23]在2015-2016年間山東、安徽和江蘇3個地區的櫻桃谷鴨群中分離到7株NGPV毒株,證實這些毒株與國內經典的GPV毒株全基因組序列相似性為92.2%～97.1%,親緣關系較近,屬于GPV毒株的一個變種;其中SDLY1602株可能由弱毒株82-0321v和野毒株GDaGPV的重組產生。我國鵝群中病原感染情況復雜,LIU等[24]發現2019年安徽12個發生痛風疫情的雛鵝養殖場的致病原為GPV和GAstV,混合感染率可達100%。NIU等[25]對山東、廣東、四川等11個省市地區的鵝群病原調查發現,GPV與H9亞型禽流感病毒、禽副黏病毒Ⅰ型、坦布蘇病毒和鵝圓環病毒存在普遍的混合感染情況。GPV與其他病原混合感染的現象在我國鵝群中也非常普遍,給GP的診斷和防控帶來了較大的負面影響。

GPV傳播方式多樣,可以通過水平傳播和經蛋垂直傳播,其中消化道感染是主要的傳播方式[1-2]。本次發生GP疫情鵝場雛鵝和青年鵝混養,雛鵝近期有GPV感染史。考慮到感染GPV雛鵝主要通過消化道途徑向外界排出病原體,且GPV病原對外界環境抵抗力較強,極容易長期污染混養的場地、用具,乃至共用的飼料和飲水[1],暗示該場青年鵝感染的GPV極可能來源于發病雛鵝排出的病原。GPV主要危害的是雛鵝、雛番鴨等幼齡階段的水禽,成年水禽能夠感染GPV發病,但多以不表現明顯臨床癥狀的隱性感染為主[1-2]。該鵝養殖場在治療雛鵝GP疫情期間,忽視了對青年鵝實施針對GPV的預防措施,給GPV感染青年鵝群提供了機會。

我國水禽養殖業中,“公司+農戶”的養殖模式非常普遍,小規模的家庭養殖模式仍占據重要的養殖地位。需要注意的是,在家庭養殖模式中,不同日齡鵝群,乃至不同物種禽群混養的情況比較普遍,飼養管理和疫病防控水平較差,禽流感病毒、禽副黏病毒Ⅰ型和GP等的疫病頻發,危害嚴重[19-20]。以本研究跟蹤的GP病例進行反思,目前國內外關于GPV病原及疫苗、卵黃抗體等防控生物制品相對成熟,我國有多家企業生產GPV疫苗和卵黃抗體商品[13]。近年來,隨著GPV生物制品的廣泛應用,我國GP多地區頻繁暴發的流行態勢逐漸緩和,局部地區的零星散發成為常態。本研究發現近年來鵝群感染的GPV毒株沒有發生較大的變異,且流行毒株與疫苗株之間存在較好的抗原一致性。結合當前GPV生物制品情況,加強飼養管理水平和水禽場生物安全防護能力,是我國當前GPV防制的重要措施。