BVDV感染對小鼠巨噬細胞IFN-β相關信號分子的影響

段明媚,曹唱唱,趙心怡,陳 斐,周 彬,姜 勝,邵春艷,周瑩珊,董婉玉,楊 楊,王曉杜*,宋厚輝*,宋泉江*

(1.浙江農林大學 動物科技學院/動物醫學學院 浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室/動物健康互聯網檢測技術浙江省工程實驗室/動物醫學與健康管理浙江省國際科技合作基地/中澳動物健康大數據分析聯合實驗室,浙江 杭州 311300;2.山東省煙臺市招遠市辛莊畜牧獸醫站,山東 煙臺 265400)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrheal,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒 (bovine viral diarrheal virus,BVDV)引起的一種極為復雜,呈現多種臨床癥狀,并在世界各地廣泛流行的傳染性疾病[1]。根據5′端非編碼區的不同,將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2,其中又可以將BVDV-1細分為BVDV(1a～1v)共22個亞型,BVDV-2分為(2a～2d)4種亞型[2-3],還有Hobi-like BVDV被稱為BVDV-3或非典型牛瘟病毒[4]。根據體外培養能否引起細胞病變,分為細胞病變型(cytopathic,CP)和非細胞病變型(non-cytopathic,NCP)[5]。

不同動物感染BVDV后會因為個體差異和毒株的差異產生不同的臨床癥狀,高毒力的毒株感染會引發腹瀉、高熱和病毒血癥等急性癥狀,而且會導致免疫抑制,進一步加重病情。BVDV還會誘發黏膜病,主要表現為發病突然,重度腹瀉,大量流涎,口腔糜爛潰瘍[6],NCP型BVDV可以造成持續性感染(persistent infection,PI),妊娠期犢牛也可以感染BVDV[7-8]。感染后的小牛免疫抑制,易感染其他病原導致死亡,部分無臨床癥狀的小牛可以長期傳播病毒[9]。HoBi-like BVDV臨床癥狀與在其他型BVDV感染中觀察到的癥狀相似。HoBi-like BVDV感染導致生產和繁殖性能下降,對牛畜牧產業造成重大損失[10]。

目前國內關于BVDV感染小鼠巨噬細胞的研究較少。本研究通過構建感染RWA264.7細胞的體外感染模型,初步探究對BVDV感染小鼠巨噬細胞干擾素相關分子的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料本研究使用的小鼠巨噬細胞RAW264.7為浙江農林大學動物預防醫學與公共衛生實驗室保存。本研究使用毒株為BVDV-NADL,該毒株由中國獸醫微生物菌種保藏中心提供,通過接種MDBK細胞擴增,并由浙江農林大學動物預防醫學與公共衛生實驗室保存。反轉錄試劑盒購自諾唯贊,STAT-1抗體購自CST公司。DMEM培養購自Gibico,DNA Marker Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司;PrimeScript RT reagent Kit試劑盒購自寶生物工程有限公司;Tirzol試劑盒購自上海英駿生物科技有限公司。IFN-β試劑盒購自R&D公司。

1.2 試驗方法分別使用0.1和3 MOI BVDV感染的RAW264.7細胞,設置空白對照組,并在不同時間點收集細胞和上清,3 000 r/min離心3 min,細胞沉淀備用。

1.3 細胞培養RAW264.7細胞用生長液(含10%胎牛血清,DMEM的培養液)培養,置于37℃、5% CO2培養箱中。

1.4 巨噬細胞中BVDV拷貝數測定根據GenBank上已公布的BVDV-NADL毒株的基因組序列,通過使用SnapGene將5′UTR基因序列連接至pET32a質粒。擴增BVDV 5′UTR基因序列,通過酶切酶連和轉化,構建BVDV標準質粒。拷貝數(copy/mL)=[質量濃度(g/mL)×6.02×1023(copy/mol)]/[M(bp)×660(g/mol)],其中M為PCR擴增片段長度與載體長度之和。將質粒設置8個稀釋度并10倍稀釋。進行熒光定量PCR檢測,體系配制見表1,反應程序見表2,繪制標準曲線。并測定巨噬細胞中BVDV拷貝數。

表1 熒光定量PCR反應體系

表2 熒光定量PCR反應程序

1.5 熒光定量PCR試驗分2組,第1組以用單獨的培養基、BVDV(0.1 MOI)培養的RAW264.7,第2組以用單獨的培養基、BVDV(3 MOI)培養的RAW264.7,均在12,24,36和48 h內收樣,利用熒光定量PCR測定TLR3、TLR7、IRF7、IRF3、STAT1、IFN-β、USP18和SOCS1的mRNA相對表達量。

1.5.1RNA的提取和反轉錄 取對數生長期RAW264.7細胞稀釋于6孔板每孔2 mL細胞液,大約1×105個細胞/mL,分為給藥對照組、攻毒組及攻毒給藥組,置37℃、5% CO2培養箱中,分別于12,24,36和48 h收集細胞,制備成單細胞懸液。按照TaKaRa Mini BEST UniversallRNA Extraction Kit說明書提取總RNA,以提取的總RNA為模板,按照TaKaRa Prime Script RT Regent Kit with gDNA Eraser(DRR047A)說明書進行反轉錄,合成的cDNA作為熒光定量PCR模板。

某型號為N300-16.7/537/537-8的300 MW機組于2006年3月投產。機組有3個臨界轉速，分別為1370 r/min、1688 r/min、1750 r/min。該機組于2017年9月大修時配套進行節能升級改造，更換了高中壓缸隔板汽封、高中壓缸前后汽封、高中壓缸過橋汽封，所有汽封間隙全部按技術規范下限調整。

1.5.2引物和相對定量PCR 引物設計用NCBI Blast,由北京擎科生物有限公司合成。基因名稱、參考序列、退火溫度及產物大小見表3。熒光定量PCR反應體系為20 μL,其中SYBR Premix Ex TaqI 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA 1 μL。反應條件為95℃預變性3 min,95℃變性10 s,60℃退火延伸30 s,40個循環。

表3 引物序列

1.6 Western blot檢測STAT1蛋白表達水平試驗分2組,分別為MOCK組、BVDV(0.1 MOI)組,將待接毒和處理的細胞鋪于6孔細胞板,當細胞密度達到80%～90%時用(0.1 MOI)BVDV NADL株感染RAW264.7細胞,37℃吸附1 h,棄掉含病毒的細胞培養液,加入完全培養基培養,分別在接毒后 24,30,36,42和48 h 收取細胞總蛋白,試驗中以β-actin為內參。使用 Thermo Fisher 試劑盒提取細胞總蛋白,收集6孔細胞板中的細胞沉淀,加入細胞裂解液混勻STAT1 多克隆抗體(1∶2 000 稀釋)作為一抗室溫孵育1.5 h,山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000 稀釋,冰上孵育 30 min,12 000 r/ min 離心10 min 后移除上清。使用微孔檢測法進行蛋白定量,計算出 BCA 工作液需要總量,將 BSA 標準品和待測蛋白樣品分別加到作好標記的試管中,每個待測樣本做了個平行反應,37℃水浴中孵育 30 min,用分光光度計在 91/84 nm 處測定樣品的D值,計算樣品的蛋白濃度。然后進行SDS-PAGE電泳,轉膜后用5%的脫脂乳粉封閉 1.5 h,二抗室溫孵育1 h,最后利用 ECL 品色液在成像儀中拍照觀察。

1.7 ELISA檢測IFN-β表達水平試驗分4組,分別為MOCK組,BVDV(0.1,3 MOI)組分別于6,12,24,36和48 h收樣,收取細胞上清,通過ELISA試劑盒檢測IFN-β的濃度。POLY(I∶C)刺激作為陽性對照。

2 結果

2.1 巨噬細胞中BVDV拷貝數測定結果發現BVDV可以進入小鼠的巨噬細胞,但病毒拷貝數并未增加(圖1)。

圖1 BVDV感染巨噬細胞后的病毒拷貝數

2.2 小鼠巨噬細胞IFN相關因子感染BVDV后表達情況

2.2.1BVDV感染對小鼠巨噬細胞TLR3和TLR7影響 結果顯示在24 h時,BVDV(3 MOI)感染后TLR3表達量顯著提高(P<0.05),而且高劑量BVDV引起的TLR3高表達相比低劑量病毒更為顯著(P<0.01)(圖2A)。BVDV(3 MOI)感染后TLR7在36 h顯著降低(P<0.05) (圖2B)。

A.TLR3轉錄水平;B.TLR7轉錄水平;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。下同

2.2.2BVDV感染對小鼠巨噬細胞IRF3和IRF7影響 BVDV(3 MOI)在感染小鼠巨噬細胞24和36 h引起IRF3表達量顯著提高(P<0.001),BVDV(0.1 MOI)在36 h引起IRF3表達量顯著提高(P< 0.05)(圖3A);BVDV(3 MOI)在24,36,48 h均能提高IRF7表達,BVDV(0.1 MOI)36和48 h造成IRF7表達量升高,而且在36和48 h兩者引起的表達量差異顯著(P<0.001)(圖3B)。

A.IRF3 mRNA轉錄水平;B.IRF7 mRNA轉錄水平

2.2.3BVDV感染對小鼠巨噬細胞STAT1影響 BVDV(3 MOI)在感染小鼠巨噬細胞12,24,36和48 h引起STAT1表達量顯著提高(P<0.001)(圖4A),BVDV(0.1 MOI)也能在24,36和48 h造成STAT1蛋白表達量顯著提高(圖4B、C)。而且高滴度BVDV(3 MOI)對STAT1表達量的促進作用高于低滴度BVDV(0.1 MOI)(圖4A)。

A.STAT1基因表達;B.STAT1蛋白表達;C.STAT1蛋白表達灰度分析

A.IFN-β基因表達;B.IFN-β濃度

A.ISG15基因表達;B.OAS1基因表達

A.USP18基因表達;B.SOCS1基因表達

2.2.4BVDV感染對小鼠巨噬細胞IFN-β影響 結果顯示高滴度BVDV(3 MOI)能提高IFN-β的基因表達量(圖5A)。高滴度BVDV(3 MOI)和低滴度BVDV(0.1 MOI)均提高IFN-Β蛋白的表達量,且高滴度BVDV對IFN-β分泌的促進作用顯著高于低滴度BVDV(圖5B)。

2.2.5BVDV感染對小鼠巨噬細胞干擾素相關抗病毒蛋白ISG15和OAS1影響 結果顯示高滴度BVDV(3 MOI)能24 h提高ISG15和OAS1的基因表達量,低滴度BVDV對ISG15和OAS1表達無影響(圖6)。

2.2.6BVDV感染對小鼠巨噬細胞干擾素負向調節因子USP18和SOCS1影響 結果顯示高滴度BVDV(3 MOI)能在24 h提高USP18基因表達量(圖7A),但是能夠一直提高SOCS1基因表達量(圖7B),低滴度BVDV(0.1 MOI)能夠在12,36,48 h提高SOCS1基因表達(圖7B),高滴度BVDV對SOCS1提高顯著高于低滴度BVDV(圖7B)。

3 討論

BVDV能夠感染奶牛、豬以及鹿等其他野生動物并嚴重影響經濟效益[17-18]。BVDV感染后動物表現出多種臨床癥狀,根據毒株不同和感染動物個體差異等原因,主要有亞臨床感染、急性感染、PI和黏膜病[19]。BVDV感染后主要可以導致免疫系統疾病、呼吸系統疾病和繁殖障礙疾病[20]。有學者構建了兔子感染BVDV模型,結果顯示BVDV在兔子的回腸中載毒量最高,并在淋巴組織表現出明顯的病變[21]。BVDV也能夠通過口服和腹腔注射感染小鼠[22-23]。由于BVDV感染也可以造成免疫抑制[24],加重腹瀉以及呼吸道疾病的癥狀,使急性感染的癥狀進一步加重并出現繼發感染[25],而且目前針對BVDV對免疫細胞尤其是巨噬細胞的影響研究相對較少,因此本試驗研究了BVDV感染對小鼠巨噬細胞的影響和調節,探究BVDV可能的逃脫免疫細胞反應的機制,為BVDV防控提供參考。

本研究結果表明,BVDV能夠吸附和進入小鼠巨噬細胞,但是不能在小鼠巨噬細胞中復制。研究證實BVDV感染小鼠十二指腸、脾臟和血液的病毒載量均在168 h達到高峰[26],說明BVDV能夠在小鼠多個組織和器官中復制。還有研究表明BVDV可以感染小鼠BALB/c外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并引起凋亡[27]。而且也可以從牛的PBMC中分離到BVDV[28]。在小鼠巨噬細胞中并未有相關報道,但是BVDV感染可以造成脾內吞噬細胞增多[29]。這可能就是因為BVDV都能夠進入小鼠巨噬細胞,但不能完成復制,同時造成小鼠病死率較低的重要原因。

盡管BVDV不能在小鼠巨噬細胞中完成復制,但是仍然可以通過TLR3和TLR7激活小鼠的先天免疫反應。BVDV感染小鼠巨噬細胞前期通過提高TLR3表達激活先天免疫反應,感染BVDV的巨噬細胞TLR7表達量也會下降,這種下降可能和BVDV在巨噬細胞中不能復制、病毒載量持續降低有關系,BVDV對不同種屬的免疫細胞研究需要繼續深入。

IRF3在機體細胞中廣泛表達,而在非免疫細胞中IRF7表達量非常低,在漿細胞樣樹突狀細胞中表達相對豐富[30],本研究顯示BVDV感染可以提高巨噬細胞中IRF3和IRF7的表達,而且IRF7的提高呈現病毒含量依賴性。也有研究表明BVDV刺激TLR3、TLR7的轉錄水平升高可以刺激IRF3和IRF7活化形成二聚體進入細胞后激活IFN-Ⅰ[31-35]。IRF7可以與IRF3發生同二聚化或異二聚化,進而誘導IFN-α/β表達[36]。NCP BVDV感染能降解牛睪丸細胞中IRF3蛋白,抑制干擾素表達[37],這可能是與感染的BVDV的生物型和宿主細胞類型有關系。因此IRF3/IRF7在BVDV激活巨噬細胞中的干擾素反應具有重要意義。

IRF7與IRF3可以在單鏈RNA病毒誘導IFN分泌過程中起到重要作用。本研究結果顯示CP型BVDV可以誘導巨噬細胞IFN-β分泌。IFN-β可以直接激活自然殺傷細胞,增強其抗病毒能力,消除感染細胞[38]。這可能也是BVDV不能在巨噬細胞完成復制的重要原因。然而NCP BVDV Erns可以降解ssRNA,阻止IFN的激活[39],因此不同生物型BVDV調控干擾素反應也不盡相同,需要進一步研究。

IFN激活可以誘導一系列干擾素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)的轉錄和免疫反應。本研究表明高劑量的BVDV能夠早期提高小鼠巨噬細胞中的ISG15和2'-5'-寡腺苷酸合成酶-1(2'-5'-oligoadenylate synthetase,OAS1)的轉錄,這也是巨噬細胞中不能復制的重要原因。有研究顯示作為IFN-Ⅰ的一種,IFN-ε激活ISG15、Mx1、OAS1的活性[40]。也有研究證明CP型和NCP型BVDV感染牛的睪丸細胞導致IRF-3轉位到細胞核,無法同ISG15結合,IRF3無法發揮抗病毒作用。因此BVDV在免疫細胞中對ISG的調節機制也是十分復雜。

IFN發揮抗病毒作用需要一些負性調控因子上調防止IFN信號通路過度激活。細胞因子信號抑制物1(suppressor of cytokine signaling,SOCS1)是IFN信號的經典抑制因子之一[41]。結果顯示BVDV感染可以上調IFN負性調節因子SOCS1的轉錄水平,防止IFN過度表達引起的免疫反應,所以在感染的后期ISG15和OAS1的高表達得到下調。也有研究顯示SOCS1的過度表達可顯著降低STAT1磷酸化后表達的IFN-Ⅰ和ISG表達[42]。TLR7激活的SOCS1和SOCS3可以強烈抑制TLR7介導的IFN-Ⅰ的產生[43]。有研究表明TLR8與SOCS-1結合可以控制TLR7介導的西尼羅病毒中樞神經系統感染小鼠抗病毒免疫[44]。

綜上CP型BVDV能夠感染小鼠巨噬細胞并引起TLR7-IRF7激活IFN-Ⅰ信號分子,促進ISG和OAS1的表達,并接受負性調節因子SOCS1等調控,但是不能在小鼠巨噬細胞中復制,具體的機制有待深入研究,為科學的防控BVDV提供參考。