不同年份老香黃活性成分、抗氧化活性及揮發性成分分析

王雅倩,安可婧,黃桂穎,余元善,肖更生,白衛東,楊啟財,楊婉媛,陳奕東

1(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510610)2(華中農業大學 食品科學技術學院,湖北 武漢,430070)3(仲愷農業工程學院 輕工食品學院/農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室,廣東 廣州,510225)4(廣東濟公保健食品有限公司,廣東 潮安,515638)5(廣東佳寶集團有限公司,廣東 潮州,515638)

老香黃,是嶺南特有的保健和藥用制品,別稱老香櫞、佛手香黃,由蕓香科植物佛手的果實炮制而成,主產于廣東、四川、浙江等地[1]。佛手果為廣東地道“十大廣藥”之一,潮州佛手果為廣東名果之一,自明代以來,就有關于佛手種植和加工的記載,如《海陽縣志》曰:“香櫞,佛手柑,梅,邑中之梅大半漬糖以入茶品,亦有用鹽曬者[2]。老香黃的制作工藝包括鹽腌、曬干、炊熟、浸中藥粉液等步驟,九蒸九曬,陳封瓦甕中數年,最后制成了果肉油亮漆黑,肉質綿綿如膏狀的老香黃,它不僅能夠促進消化、理氣和胃,還能舒緩胃脹、嗝噎、痰多、咳嗽,甚至解酒[3]。

佛手中含有多種生物活性成分,包括精油、黃酮類化合物、多糖、香豆素和酚酸等[1],是我國傳統的名貴中藥。《本草從新》記載:“佛手,性雖中和。單用多用。亦損正氣。須與參術并行。陳久者良”[4]。在傳統觀念中認為,老香黃制成后,保存愈久藥效愈佳,身價也愈高[5]。目前關于老香黃的研究在國內外報道不多,主要集中在質量安全、成分、指紋圖譜、化學模式識別及相關工藝等方面的研究。如郭舒臣等[6]采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)建立了一種化學模式識別技術快速判別不同年份老香黃的方法,并篩選出6個差異性化學標志物,其中貢獻最大的標志性化合物為5,7-二甲氧基香豆素;陳小愛等[7]采用電子鼻、GC-MS和氣相-離子遷移譜技術(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)分析老香黃發酵期間的揮發性成分變化,研究表明,β-蒎烯和1-石竹烯在發酵12個月樣品中含量最高;檸檬烯、茴香腦和2,4-二甲基苯乙烯在老香黃發酵2個月時含量達到最高;異松油烯、麥芽酚和芳樟醇在樣品發酵4個月時含量最高;α-松油醇和糠醛分別在發酵6個月和8個月時含量為最高。對老香黃風味貢獻程度最大的5個物質分別是香茅醛、壬醛、異松油烯、反式-β-羅勒烯和檸檬烯;林良靜等[8]采用GC-IMS結合ROAV鑒定出佛手香黃的特征性香氣成分主要由甲硫基丙醛和烯萜類物質組成,呈現果香、花香的香氣特征。這些研究目前僅停留在對老香黃活性成分的分析及揮發性物質的鑒定等,并無系統地研究不同貯藏年份對老香黃主要黃酮類化合物、總酚總黃酮、抗氧化性及揮發性成分的影響[9]。

基于此,本文以不同貯藏年份的老香黃為研究對象,結合高效液相色譜、體外抗氧化評價、氣相色譜-質譜聯用儀等技術,探究不同貯藏年份老香黃黃酮類化合物,抗氧化活性及揮發性成分的變化,以期尋找不同年份老香黃品質變化的物質基礎,旨在為老香黃“陳久者良”提供科學依據,也為老香黃在貯藏期間的品質形成提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年、2019年、2017年、2015年和2013年腌制的佛手(對應分別貯藏1年、2年、4年、6年和8年),每個年份各3批,廣東濟公保健食品有限公司;福林-酚,上海瑞永生科技有限公司;DPPH、ABTS、TPTZ、水溶性維生素E(Trolox)、5,7-二甲氧基香豆素、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、紫丁香苷、兒茶素、甲氧橙皮苷標準品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1800型紫外分光光度計、LC-20AT型高效液相色譜儀,島津儀器(蘇州)有限公司;DL-800B型智能超聲波清洗器,上海之信儀器有限公司;DB-5非極性毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、DB-WAX極性毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm ID,0.25 μm),美國Restek;7890B-5977B型氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent科技公司;57330-U型三相固相微萃取頭(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene/Carboxen,PDMS/DVB/CAR),美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取液的制備

參照鄧祥等[10]的方法,采用超聲波輔助法提取。將5個貯藏年份的老香黃樣品打粉,分別稱取粉末10 g于小燒杯中,加15 mL酸化甲醇常溫提取。超聲30 min,過濾,收集上清液。對濾渣重復上述操作提取,直至濾液基本無色,合并濾液,定容至50 mL容量瓶,保存備用。

1.3.2 黃酮類單體化合物含量的測定

參考陳小愛等[7]的方法并加以修改。Waters C18柱(4.6 mm×250 mm),流動相為體積分數0.1%甲酸(A)-甲醇(D),檢測波長:280和330 nm,進樣體積10 μL,柱溫35 ℃;梯度洗脫程序:0～10 min,40%～60% D;10～20 min,60%～80% D;20～30 min,80%～100% D;30～35 min,100%～40% D;35～40 min,40% D;流速0.9 mL/min。分別取1 mL樣品提取液過0.22 μm微孔濾膜后進行液相分析,色譜條件如上,每個樣品重復3次。

1.3.3 總酚和總黃酮含量及抗氧化能力的測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu[11]比色法。以沒食子酸質量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,總酚含量以相當沒食子酸質量表示(mg GAE/d.w.)。

總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH[12]法。以蘆丁質量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,總黃酮含量以蘆丁當量表示(mg Rutin/g d.w.)。

DPPH自由基清除能力測定參照ZHANG等[13]的方法。以Trolox標準品濃度(mmol/L)為橫坐標,自由基清除率為縱坐標繪制標準曲線,DPPH自由基清除能力以Trolox當量表示(mmol Trolox/100 g)。

ABTS陽離子自由基清除能力測定參考CHOI等[14]的方法,并略作修改。以Trolox標準品清除率為縱坐標,各清除率對應的標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。ABTS陽離子自由基清除能力以Trolox當量表示(mmol Trolox/100 g)。

鐵離子還原能力(ferric reducing/antioxidant power, FRAP)測定抗氧化活性參照ZHANG等[13]的方法。以標準品吸光度為縱坐標,各吸光度對應的標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。Fe3+還原力以維生素C當量表示(mg VC/100 g)。

1.3.4 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術分析

揮發性芳香組分的固相微萃取提取:參考CHEN等[15]和徐婭瑩[16]的方法,略有所修改。稱取6.0 g樣品于15 mL萃取瓶中,加2 mL飽和NaCl溶液及10 μL體積分數0.1%內標1-己醇,50 ℃平衡20 min;隨后將三相纖維頭(PDMS/DVB/CAR)置于樣品上方的空氣中,50 ℃萃取30 min后,迅速將纖維頭插入氣相色譜儀的進樣口,解析10 min,同時啟動氣相色譜儀采集數據。

GC-MS條件:參考陳小愛等[7]和SONG等[17]的方法,略有所修改。采用DB-WAX彈性毛細管柱,載氣為氦氣,流速1.0 mL/min,進樣口溫度270 ℃。色譜柱升溫程序:初始溫度40 ℃,保持3 min,然后2 ℃/min升溫至100 ℃,最后5 ℃/min加熱到230 ℃,保持10 min,采用不分流進樣模式。質譜條件:采用全掃描模式采集信號,電離方式EI,電子轟擊能量為70 eV;接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,掃描質量范圍35～350 amu,倍增器電壓;掃描速度:5.2 次/s。

GC-MS定性分析:與標準信息庫NIST16進行比對;采用正構系列烷烴混合標樣C5～C20計算揮發性成分的保留指數,并與參考文獻進行對比;根據所記錄香氣描述以及利用標準品的質譜信息進行定性。保留指數(linear retention index, LRI)[18]的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:N,目標物質左側正構烷烴的碳原子數;n,位于目標物質兩側的正構烷烴的碳分子數之差;tRa,tRN和tR(N+n)分別是待測物質左側和右側正構烷烴的保留時間。

GC-MS定量分析:各揮發性物質的相對含量用化合物的峰面積與內標物的峰面積的比值即濃度的比值計算得出。

1.4 數據統計分析

采用Excel、Origin 8.0、R軟件統計分析實驗數據及制圖;采用SPSS(v.19)進行單因素方差分析和顯著性分析。老香黃的抗氧化能力與黃酮類化合物的相關性分析采用Pearson類型,相關系數顯著性采用雙尾檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 不同年份老香黃中黃酮化合物的種類及含量

根據樣品色譜圖1和圖2,結果如表1所示,5個不同貯藏年份的老香黃樣品黃酮類化合物組成有:5,7-二甲氧基香豆素、蘆丁、綠原酸、阿魏酸、紫丁香苷、甲氧橙皮苷和兒茶素,其種類基本相同,但是含量存在顯著變化。其中,綠原酸在6年老香黃樣品中含量最高,為13.4 μg/g,較2年老香黃提高3.05倍;阿魏酸在8年老香黃中含量最高,4年老香黃含量最低;兒茶素在6年老香黃含量最高為161.23 μg/g,是含量最低的1年老香黃的2.74倍。而蘆丁在2年老香黃含量最高,8年老香黃含量最低;紫丁香苷在一年老香黃含量最高,8年老香黃含量最低;5,7-二甲氧基香豆素和甲氧橙皮苷分別在1年和2年老香黃樣品中含量最高,為47.57和37.22 μg/g,而在4年老香黃樣品中含量最低,分別為11.44、19.10 μg/g。由于樣品是不同年份采摘的不同批次樣品,所以部分黃酮類化合物隨貯藏年份的不規則變化規律可能是由于樣品本身的差異導致。

圖1 樣品色譜圖(330 nm)Fig.1 Sample chromatogram (330 nm)

圖2 樣品色譜圖(280 nm)Fig.2 Sample chromatogram (280 nm)

但從整體來看,隨著老香黃貯藏年份的增加,綠原酸、阿魏酸和兒茶素含量呈上升趨勢,而5,7-二甲氧基香豆素、蘆丁、紫丁香苷和甲氧橙皮苷含量呈現下降趨勢。這是由于老香黃在制作、貯藏過程中黃酮類物質會發生變化。如劉志聰等[19]報道,在老香黃制作過程中,紫丁香苷、5,7-二甲氧基香豆素、蘆丁、甲氧橙皮苷、綠原酸、阿魏酸和兒茶素等黃酮類物質經過多道工藝的炮制,特別是鹽浸和蒸煮等工藝發生了嚴重的流失;其次,在老香黃貯藏過程中,紫丁香苷、5,7-二甲氧基香豆素、蘆丁和甲氧橙皮苷可能在微生物作用下會轉化為其他二級代謝產物如葡萄糖苷等,從而導致上述黃酮類化合物含量下降[20]。此外,裴科等[21]發現了一些未失去活性的酶如纖維素酶會將綠原酸、阿魏酸和兒茶素從纖維素結構中水解,從而使其含量增高。

紫丁香苷在不同年份老香黃中含量均較高,它具有抗氧化等生物活性,老香黃的加工、貯藏過程會使其降解,但研究表明綠原酸、阿魏酸和兒茶素均較紫丁香苷的抗氧化性強[22],所以紫丁香苷含量的下降并不會影響老香黃隨貯藏年份增加抗氧化性的增強,它對老香黃藥效的其他影響,有待進一步思考和研究。大量研究表明5,7-二甲氧基香豆素是佛手的標志性成分[23],在本研究中也發現不同年份老香黃樣品都可以檢測到5,7-二甲氧基香豆素,其含量在不同貯藏年份變化不規律,但整體呈現下降趨勢,據郭舒臣等[6]報道其含量在佛手果實不同成熟階段變化很大,根據含量可作為標志物來判斷老香黃的大概年份。

2.2 不同年份老香黃的總酚、總黃酮含量及抗氧化能力變化

由圖3可知,不同年份老香黃的總酚、總黃酮含量變化趨勢一致,整體表現為6年和8年>2年和4年>1年,說明隨著貯藏年限的增加,老香黃的總酚、總黃酮含量增加。其中6年老香黃總酚、總黃酮含量最高,分別為2.42、1.49 mg/g;1年老香黃總酚、總黃酮含量最低。

圖3 不同年份老香黃總酚、總黃酮含量變化Fig.3 Changes of total phenols and flavonoids in Laoxianghuang in different years注:圖柱上不同小寫字母表示不同貯藏年份老香黃間差異顯著(P<0.05)。

此外,由表2可知,隨著貯藏時間的延長,老香黃提取物的DPPH清除能力變化趨勢為:6年和8年>2年和4年>1年;ABTS陽離子自由基清除能力也顯示6年老香黃的清除能力最強,為0.64 mmol Trolox/100 g,較清除率最低的1年老香黃提高1.64倍;Fe3+的還原能力變化趨勢顯示6年和8年>2年和4年>1年。這表明在檢測年限內,老香黃的抗氧化性隨著貯藏年份的增加而提高,與總酚、總黃酮的變化趨勢一致。這可能是由于以下幾點原因導致:黃酮等酚類化合物經多道工藝(鹽腌、炮制)發生了由結合態向游離態的轉變,生物利用率提高了[12];此外,老香黃貯藏過程中,在黑曲霉等微生物的作用下,發生了黃酮類化合物的積累和轉化,比如黑曲霉產生的β-葡糖糖酶主要用于黃酮苷與苷元的轉化,從而導致總酚、總黃酮含量增加[20]。大量的研究結果證實[24],總酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間存在高度相關性。根據表3相關性分析,不同年份老香黃的DPPH和ABTS陽離子清除能力以及Fe3+還原能力分別與總酚、總黃酮、綠原酸、阿魏酸、兒茶素含量呈極顯著正相關性(P<0.01);而與5,7-二甲氧基香豆素、甲氧橙皮素不存在顯著相關性(P>0.05);與蘆丁、紫丁香苷含量存在極顯著負相關性(P<0.01)。這表明隨著老香黃貯藏年限的增加,兒茶素、綠原酸和阿魏酸是對老香黃抗氧化能力起主要貢獻作用的活性物質。根據KADOMA等[22]的報道,綠原酸、阿魏酸和兒茶素是屬于抗氧化性較強的黃酮類化合物,其含量增加,也會導致抗氧化性增強。這也是隨著貯藏年限增加,老香黃抗氧化性增強的又一原因。

表2 不同年份老香黃抗氧化能力的變化Table 2 Changes of antioxidant capacity of Laoxianghuang in different years

表3 不同年份老香黃中總酚、總黃酮含量、抗氧化特性(FRAP、DPPH和ABTS)以及活性物質之間的相關性Table 3 Correlation between total phenols, total flavonoids, antioxidant properties (FRAP, DPPH and ABTS) and active substances in Laoxianghuang in different years

2.3 不同年份老香黃揮發性成分的變化

老香黃的主要揮發性成份為萜烯類、醇類和芳香烴類化合物,也是老香黃風味物質的主要來源[8]。由圖4～圖6可知,不同年份老香黃的揮發性物質種類和相對含量差異較大。分別從1年、2年、4年、6年和8年老香黃中檢測出65、61、68、65和63種揮發性成分。并且隨著貯藏年限的增加,萜烯類和芳香烴類物質的個數和含量整體呈下降趨勢,而醇類物質個數和含量整體呈上升趨勢。其中,1年老香黃中萜烯類化合物有13個,含量為28 165.15 μg/g,占總物質含量的79.98%;芳香烴類化合物有15個,含量為3 169.73 μg/g,占總物質含量的15.9%;醇類化合物15個,含量為1 250.29 μg/g,占總物質含量的4.05%。隨著貯藏年限增加,8年老香黃總萜烯類物質數量下降到8個,含量為1 060.41 μg/g,占總物質含量的20.87%,相比1年老香黃下降了59.11%;芳香烴類化合物數量下降到11個,含量為476.56 μg/g,占整體物質含量的9.26%,相比1年老香黃下降了6.64%;而醇類在8年老香黃中增加到17個,且相對含量最高,為1 746.80 μg/g,占總物質含量的35.64%,相比1年老香黃上升了31.59%。由此可知,隨著貯藏年限的增加,老香黃特征性揮發成分萜烯類和芳香烴類物質含量降低,而醇類物質含量升高。檸檬烯是老香黃中最主要的烯烴類化合物,其在2年老香黃的老香黃中含量最高,為44 991.8 μg/g,隨貯藏時間的延長含量急劇減少,到8年老香黃下降到了585.71 μg/g;乙醇、α-萜品醇和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-3-環己烯-1-醇是老香黃中最主要的醇類化合物,隨著貯藏時間的延長,含量均呈上升趨勢。

圖4 五個貯藏年份老香黃中揮發性物質的種類組成Fig.4 Species composition of volatile substances in Laoxianghuang in five storage years

圖5 五個貯藏年份老香黃中各類揮發性物質的含量Fig.5 Contents of various volatile substances in Laoxianghuang in five storage years

圖6 五個貯藏年份老香黃中各類揮發性物質的含量Fig.6 Contents of various volatile substances in Laoxianghuang in five storage years

為了進一步研究不同年份老香黃揮發性成分的差異,通過揮發性物質含量構建主成分分析(principal component analysis, PCA)模型,由圖7-a可知,在PCA得分圖中可以將5個不同年份老香黃分成3組,4年和1年老香黃,8年和6年老香黃,以及2年老香黃。由載荷圖圖7-b和增強出版附件1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033818)顯示,4年和1年老香黃中主要揮發性貢獻物質為檸檬烯、α-萜品醇、苯甲酸和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯等,具有柑橘香、檸檬特征香、清甜花香、松香和松節油香等氣味;2年老香黃中檸檬烯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯和(S)1-甲基-4-(5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基)-環己烯等為主要揮發性貢獻物質,具有柑橘香、藥草香、果香、松香和松節油香等氣味;8年和6年老香黃中主要香氣貢獻物質為檸檬烯、α-萜品醇、苯甲酸、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯和糠醛等,具有花香、藥香、醇香和焦甜香等氣味。由此可知,老香黃在貯藏過程中,揮發性香氣成分由檸檬香、柑橘香、松香向花香、藥香、醇香轉變。

a-得分圖;b-載荷圖圖7 不同年份老香黃GC-MS的主成分分析圖Fig.7 Principal component analysis of Laoxianghuang in different years by GC-MS

檸檬烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯等萜烯類化合物下降以及α-萜品醇等醇類化合物上升的主要原因是老香黃在貯藏過程中長期暴露于有氧環境下,萜烯類化合物發生了氧化反應而減少[25],此外,VESPERMANN等[26]研究發現,在黑曲霉等微生物的作用下萜烯類化合物向醇類和烷烴類物質發生轉變,如α-蒎烯在黑曲霉的作用下可轉化為α-萜品醇,從而導致萜烯類含量降低,醇類物質增加。此外,老香黃貯藏過程中酵母菌可以利用糖分生成乙醇和CO2,使醇類化合物含量升高[21]。在中藥傳統經驗上,認為“陳久者良”其中依據之一就是氣味“香醇”[27],上述風味物質的轉變為老香黃“陳久者良”的說法找到了根據。

3 結論

隨著貯藏時間的延長,老香黃總酚、總黃酮含量增加,抗氧化能力增強,其中綠原酸、阿魏酸和兒茶素含量與總黃酮、總酚含量、抗氧化能力呈正相關。GC-MS結果顯示,萜烯類、醇類和芳香烴類化合物是老香黃主要的揮發性物質,也是老香黃風味物質的主要來源,在貯藏過程中檸檬烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯等烯烴類物質的含量逐漸減少,同時乙醇、α-萜品醇和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-3-環己烯-1-醇等醇類物質的含量逐漸增加,香氣成分由檸檬香、藥草香、松香向醇香、花香、焦甜香轉變,氣味隨之變香醇。上述黃酮類化合物、抗氧化性以及揮發性成分的變化規律可為老香黃“陳久者良”提供科學依據,也為老香黃貯藏期間的品質形成規律提供參考。