三種形態藍靛果花色苷的提取工藝及其抗氧化活性研究

劉英,秦程玉,吳嘉儀,周文玲,李德文*

1(東北林業大學 化學化工與資源利用學院,黑龍江 哈爾濱,150040)2(東北林業大學,森林植物生態學教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱,150040)

藍靛果(LoniciceracaeruleaL.)是忍冬科,忍冬屬藍果忍冬的變種,又名山茄子、黑瞎子果等,其果實是一種藍黑色或紫色漿果,多為長圓形,味道微酸,略帶苦澀[1],主產于中國吉、黑、蒙等地,分布廣泛[2],具有良好的經濟價值、營養價值和藥用價值。藍靛果中富含花色苷、黃酮類物質、多酚等營養成分[3-5],其果實中花色苷含量較高。大量研究表明:花色苷具有抗氧化、抗癌、抗肝損傷、抗突變、預防糖尿病等作用[6-10]。隨著藍靛果大面積的種植、產量增加和加工技術不斷提高,市場上把藍靛果的鮮果加工成干果、凍干粉等形態,因此,比較不同形態的藍靛果中花色苷的提取量,對藍靛果的儲運具有重要的參考價值。

常見的花色苷提取方法有傳統的溶劑提取、超臨界流體萃取、酶提取及超聲輔助提取法等。超聲輔助提取法是采用超聲波輔助溶劑進行提取,超聲波產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用,破壞物料細胞,使溶劑滲透到物料細胞中,縮短提取時間,提高提取率。相較于溶劑提取法,超聲輔助提取時間短、提取效率高[11-12];相較于超臨界流體萃取,超聲輔助提取法運行成本較低;相較于酶提取法,超聲波的空化效應保持花色苷的結構和活性成分不變、更好地保護花色苷的結構。

目前,影響超聲輔助提取法的因素有:乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度、超聲功率和料液比等。花色苷會被強大的沖擊波破壞細胞結構使其破裂,可以縮短提取時間和減少廢棄物的產生,超聲波時間過長使得花色苷剪切分子結構出現變化致使提取量下降[13];花色苷會隨著超聲溫度的升高而增大其溶解度,過高的溫度也會降低花色苷的穩定性,導致花色苷的降解,提取量反而下降[14]。花色苷通常在弱堿性或中性條件下不易提取且不穩定,所以提取時通常采用酸化的乙醇溶液,酸化的乙醇溶液可以在提取時破壞植物細胞膜的同時溶解其中的花色苷。近年來,有關乙醇體積分數變化影響鮮果中花色苷提取量的研究較多,如:周新宇等[15]在刺玫果花色苷最優提取條件下可以得出乙醇體積分數為60%;李鳳鳳等[16]研究發現乙醇體積分數為85%時,對藍靛果花色苷提取量最佳。但有關乙醇體積分數變化、超聲時間和超聲溫度對藍靛果干果和凍干粉中花色苷提取量影響的研究較少,需加強研究。

本研究以花色苷提取量為評價標準,采用超聲輔助的方法,優化乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度3個因素,確定不同形態的藍靛果(鮮果、干果和凍干粉)中花色苷的最佳提取方法;利用體外抗氧化活性方法評價不同形態的藍靛果中花色苷的清除自由基能力,確保花色苷的功效。同時對藍靛果的儲運提供了一定的參考價值,有利于推動藍靛果產品的深度開發和利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

藍靛果鮮果,伊春市鑫野實業有限公司;藍靛果干果、凍干粉,黑龍江大興安嶺塔河縣綠野山產品開發有限公司。藍靛果鮮果、干果和凍干粉含水量分別為75%、14.50%和9.50%。

無水乙醇、濃HCl、K2S2O8、抗壞血酸(均為國產分析純)、DPPH、ABTS(均為阿拉丁試劑),北京博奧拓達科技有限公司。

KQ-250E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計,島津儀器有限公司;FA1004B型電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;AQ-180E型粉碎機,慈溪耐歐貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍靛果前處理

藍靛果鮮果和干果清洗后,晾干,分別密封在容量瓶里,凍干粉直接存入容量瓶密封,放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 藍靛果花色苷提取工藝

藍靛果前處理→粉碎至粗粉→按考察的實驗條件進行超聲提取→重復浸提3次,抽濾后合并提取液→藍靛果花色苷粗提液→消光系數法計算提取量

1.2.3 藍靛果花色苷提取量測定

取制備的藍靛果花色苷提取液2 mL,定容到50 mL容量瓶中后振蕩并搖勻,用超純水做空白對照,在535 nm處測定吸光值。根據孫興麗等[17]消光系數法測定花色苷提取量。花色苷提取量的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:OD,稀釋后溶液的吸光值;DV,稀釋倍數;TEV,提取液總體積,mL;CrW,樣品質量,g;98.2,1%的花色苷1 mol消光系數。

1.2.4 單因素試驗設計

準確稱取5 g藍靛果鮮果、干果和凍干粉各5份,以藍靛果花色苷的提取量為衡量指標,分別考察乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度3個因素對花色苷提取量的影響,功率為100 W,乙醇體積分數40%、65%、80%、95%、100%[18],超聲時間0、10、20、30、40 min[19],超聲溫度20、25、30、35、40 ℃[20]條件下超聲提取,每個處理做3個平行。

1.2.5 DPPH自由基清除活性的測定

選取藍靛果干果提取液2 mL,稀釋成不同質量濃度(0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL)定容至20 mL,實驗備用。參照WANG等[21]的方法并稍作修改。用分析天平稱取2.0 mg的DPPH,用無水乙醇溶解并定容到50 mL的容量瓶中,配制成0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液,吸取2 mL系列濃度藍靛果干果提取液置于比色管中,加入2 mL DPPH乙醇溶液充分混勻,避光反應30 min后在517 nm處測定吸光度值A0,用2 mL的乙醇溶液分別代替系列濃度藍靛果干果提取液和DPPH乙醇溶液,重復上述操作,分別測定吸光度值A1和A2,用抗壞血酸作為陽性對照,平行測定3次,DPPH自由基清除率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,樣品組吸光度值;A1,空白組吸光度值;A2,對照組吸光度值。

1.2.6 ABTS陽離子自由基清除活性的測定

(3)

式中:A0,空白組吸光度值;A1,樣品組吸光度值;A2,對照組吸光度值。

1.2.7 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素試驗中Duncan’s多重差異顯著性分析并計算樣品對各自由基清除能力為50%時的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。實驗數據圖采用GraphPad Prism進行繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對藍靛果花色苷提取量的影響

如圖1所示,乙醇體積分數對花色苷提取量的影響具有顯著性差異(P<0.05)。在藍靛果凍干粉和干果中,隨著乙醇體積分數的增加,花色苷的提取量也逐漸增加,在乙醇體積分數為95%時,花色苷的提取量達到最大。藍靛果鮮果中,乙醇的體積分數為65%時,花色苷的提取量達到峰值,與陳智玲等[23]采用超高壓提取藍莓渣花色苷的研究結果相似。而后隨著乙醇體積分數增加,花色苷的提取量下降,可能是由于鮮果失去水分,含糖量升高使其不易溶解;另一方面65%的乙醇與藍靛果鮮果中的花色苷極性相似,在這種相似相溶的情況下,花色苷提取量最大,當乙醇體積分數過高時,溶液極性降低,花色苷無法被萃取出來,導致花色苷的提取量變少。因此,藍靛果凍干粉和干果提取花色苷的最佳乙醇體積分數為95%,鮮果提取花色苷的最佳乙醇體積分數為65%。

圖1 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on anthocyanins extraction注:小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.2 超聲時間對藍靛果花色苷提取量的影響

如圖2所示,超聲時間在0～30 min時,干果和鮮果花色苷提取量分別從20.11、8.76 mg/5 g上升至21.70、10.14 mg/5 g,經SPSS 19.0顯著性分析,P=0.806(P>0.05)和P=0.203(P>0.05),說明超聲時間在0～30 min藍靛果花色苷提取量無顯著性差異,造成這種情況可能是干果和鮮果經充分破碎和高速振蕩提取后,花色苷能快速溶出;凍干粉花色苷提取量從84.31 mg/5 g上升至121.1 mg/5 g,說明超聲時間對藍靛果凍干粉花色苷提取量的影響差異顯著(P<0.05)。當超聲時間為30 min時,花色苷的提取量均達到峰值,但當超聲時間延長為40 min時,提取量略有下降,可能是超聲時間延長,花色苷的結構被破壞,造成一些不被需要的雜質也被萃取出[24],進而影響花色苷的提取量。因此,花色苷提取的最適時間為30 min。

圖2 超聲時間對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on anthocyanin extraction

2.1.3 超聲溫度對藍靛果花色苷提取量的影響

如圖3所示,超聲溫度對藍靛果鮮果和干果花色苷提取量的影響具有顯著性差異(P<0.05),當提取溫度處于20～35 ℃ 時,藍靛果鮮果和干果花色苷提取量隨溫度升高急劇增加,但藍靛果凍干粉花色苷提取量隨溫度升高增加緩慢,凍干粉花色苷提取量從113.27 mg/5 g上升至120.57 mg/5 g,說明超聲時間在0～30 min之間無顯著性差異(P>0.05)。在35 ℃ 時提取量均達到峰值,這種現象和周麗萍等[25]采用超聲波輔助逆流提取蓓蕾藍靛果花色苷的特點相符合。溫度35～40 ℃時,藍靛果花色苷提取量均略有下降,可能是由于溫度過高導致花色苷結構遭到破壞,花色苷的提取量反而下降。因此,花色苷提取的最適溫度為35 ℃。

圖3 超聲溫度對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanin extraction

2.2 三種形態的藍靛果花色苷的提取量

如圖4所示,5 g藍靛果鮮果、干果和凍干粉中花色苷的提取量為10.40、22.20、121.50 mg,鮮果和干果中花色苷提取量與萬山[26]和張聰等[19]的研究結果相似。顯著性分析結果表明,鮮果,干果和凍干粉中花色苷提取量之間分別存在顯著性差異(P<0.05),因此,3種形態的藍靛果花色苷提取量之間存在顯著性差異(P<0.05)。藍靛果凍干粉花色苷提取量最高,其次是干果,鮮果花色苷提取量最少。干果的花色苷提取量高于鮮果的花色苷提取量,是因為制作藍靛果干果時經過干燥、晾曬等步驟,使得其中的水分大量蒸發,重量減輕。但其中的花色苷沒有受到破壞,還因為水分散失而濃縮,含量比鮮果高。參考李景等[27]的研究,可知1 kg干果由 6～7 kg鮮果才能制得,那么每5 g干果花色苷是由30～35 g鮮果制成,30～35 g藍靛果鮮果中花色苷的提取量為133.15～155.34 mg(根據本實驗結果推算),接近5 g藍靛果干果中花色苷的提取量,即是鮮果花色苷提取量的6倍。1 kg藍靛果凍干粉是由10～20 kg鮮果制得,每5 g藍靛果凍干粉花色苷是由50～100 g藍靛果鮮果制成,50～100 g藍靛果鮮果中花色苷的提取量為221.91～443.82 mg,凍干粉中花色苷的提取量遠高于鮮果中花色苷提取量,這可能由于藍靛果鮮果制成凍干粉過程中的一些揮發性成分損失很小,能很好保留原有鮮果中的營養成分,使其組織結構保存較好,含水量較低,致使相同提取條件下,藍靛果鮮果中花色苷的提取量遠不及藍靛果凍干粉花色苷。

圖4 三種藍靛果中花色苷的提取量Fig.4 Extraction of anthocyanins from three kinds of L.edulis

2.3 抗氧化活性測定結果

2.3.1 藍靛果凍干粉花色苷DPPH自由基清除能力

DPPH自由基存在單電子,在517 nm處,其醇溶液呈紫色[28]。因為反應體系中的自由基清除劑能給DPPH自由基提供電子和氫原子,使單電子配對,從而DPPH自由基溶液發生褪色。褪色程度越大說明清除DPPH自由基的能力越強[29]。如圖5所示,當質量濃度在0.02～0.1 mg/mL,藍靛果花色苷對DPPH自由基的清除能力顯著性增強(P<0.05)。藍靛果花色苷和維生素C溶液對照組在質量濃度為0.1 mg/mL時,清除DPPH自由基的能力都達到最大,清除率分別為84.79%和98.54%。經SPSS軟件計算得出藍靛果花色苷提取液和維生素C溶液對照組的IC50值分別為47.490和32.981 μg/mL。因此藍靛果花色苷提取液和維生素C溶液對照組對DPPH自由基均能較好地清除,且清除率隨質量濃度增加而增強。

圖5 花色苷和維生素C對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of anthocyanins and vitamin C

2.3.2 藍靛果凍干粉花色苷ABTS陽離子自由基清除能力

使ABTS溶液和K2S2O8溶液混合,從而氧化成綠色的ABTS陽離子自由基,當抗氧化劑和ABTS陽離子起作用后ABTS陽離子的顏色消失,因此ABTS陽離子法廣泛應用于評價抗氧化劑清除自由基的能力,且方法簡單快速[30]。如圖6所示,藍靛果花色苷提取液和維生素C溶液對照組均具有一定的清除ABTS自由基能力,藍靛果花色苷提取液清除ABTS陽離子自由基能力弱于同濃度時維生素C溶液對照組(P<0.05)。當質量濃度在0.02～0.1 mg/mL,藍靛果花色苷提取液和維生素C溶液對照組對ABTS陽離子的清除率均隨質量濃度增加而增加,通過SPSS軟件計算得出藍靛果花色苷提取液和維生素C溶液對照組對ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值分別為59.600和38.661 μg/mL。

圖6 花色苷和維生素C對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.6 ABTS cation free radical scavenging effect of anthocyanins and vitamin C

2.3.3 三種形態的藍靛果對DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力

由表1可知,在最佳提取條件下,稀釋了25倍的藍靛果鮮果、干果和凍干粉提取液中花色苷的提取量并不一樣,但3種形態的藍靛果對于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力沒有因為果實形態的變化而受到破壞,并且3種形態的藍靛果都對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基有著極強的清除能力,這說明藍靛果中其他的成分也具有抗氧化性,還需進一步的研究。

表1 三種形態的藍靛果對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率Table 1 The scavenging efficiency of three kinds of Lonicera edulis to DPPH free radical and Abts free radical

3 結論

本文采用超聲波輔助提取3種形態的藍靛果(鮮果、干果和凍干粉)中的花色苷,通過單因素優化實驗,確定最佳提取條件為:提取凍干粉和干果的最佳乙醇體積分數為95%;提取鮮果的最佳乙醇分數為65%;3種形態的藍靛果的最佳超聲時間均為30 min、最佳超聲溫度均為35 ℃,且花色苷提取量變化為:凍干粉[(121.50±4.73) mg/5 g]>干果[(22.20±2.08) mg/5 g]>鮮果[(10.40±1.05) mg/5 g]。通過藍靛果花色苷的體外清除自由基實驗,表明與藍靛果鮮果和干果相比,凍干粉的抗氧化能力沒有削弱,其清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的IC50分別為47.490和59.600 μg/mL。綜上,相比較,凍干粉形態的藍靛果更具有儲存和運輸優勢,為藍靛果產品的深加工提供一定的參考價值。