K+誘導豆腐柴果膠凝膠化

賀超,尹樂斌*,何攀,鄒文廣,劉聰,龍盼,李敏娟

1(邵陽學院 食品與化學工程學院,湖南 邵陽,422000)2(中南糧油食品科學研究院有限公司,湖南 長沙,410000)

果膠廣泛分布于高等植物的初生細胞壁和細胞間區域,由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成[1]。天然果膠類物質以原果膠、果膠、果膠酸的形態廣泛存在于植物的果實、根、莖和葉中,是細胞壁的一種組成成分,它們伴隨纖維素而存在,構成相鄰細胞中間層黏結物,使植物細胞緊緊黏結在一起[2]。根據酯化程度,果膠可分為高甲氧基果膠(high methoxyl pectin,HMP)[酯化度(degree of esterification,DE)>50%]和低甲氧基果膠(low methoxyl pectin,LMP) (DE<50%)[3]。HMP凝膠在低pH和高糖濃度下形成,由于在低pH值下可以防止羧基的解離,高度水解和帶電荷的羧基被轉化為不帶電荷的羧基分子,分子間的斥力減小,分子的水合作用減弱,促進了分子間結合和三維網絡結構[4]。糖和酸并不是LMP凝膠化的必要條件,二價陽離子如Ca2+通常用于誘導其凝膠化,當二價陽離子加入LMP溶液時,Ca2+和果膠鏈上游離的羧基之間被描述為“蛋箱”模型的交聯相互作用[5]。通常,單價陽離子不會引起果膠的膠凝,在堿性pH下向HMP中加入單價陽離子會導致HMP的膠凝,這取決于單價陽離子和果膠的濃度[6]。CHEN等[7]在AOP 中加入單價陽離子導致了 AOP 的凝膠化,隨著單價陽離子和果膠濃度的增加,果膠凝膠的形態和結構變得更加致密,凝膠強度增加,單價陽離子和游離羧基之間的屏蔽和靜電吸引可能主導HMP的凝膠化[8]。

神仙豆腐是從豆腐柴中提取果膠凝膠后形成的產品,含有豐富的果膠、蛋白質、脂肪、纖維素、異黃酮、維生素、礦物質等營養成分,具有極高的營養價值,是最具開發和食用潛力的營養食品之一[9]。其主要原料豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz),又名豆腐木、豆腐葉、臭黃荊、觀音桔、土黃芪、腐婢等,為馬鞭草科豆腐柴屬多年生落葉灌木,營養成分豐富,富含果膠和蛋白質,是一種新型的食藥兩用型植物,主要分布于我國的陜西南部、云南、四川、貴州、浙江、湖北、湖南等地。用草酸銨從豆腐柴中提取出的果膠 AOP 是一種富含低酯化度(DE:14.26%)和高半乳糖醛酸LMP,該特性有助于果膠發揮良好的膠凝性能。

本文研究了K+誘導AOP凝膠化,通過動態流變測試、硬度測試、保水性(water holding capacity,WHC)測試、X射線衍射光譜(X-ray diffraction,XRD)測試、微觀結構觀察、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)測試和凝膠作用力進一步探討了K+對AOP凝膠的影響。研究結果可為一價陽離子誘導果膠凝膠化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐柴葉粉,嵐皋縣綠竹食品有限公司;KCl,天津化學試劑有限公司;尿素,廣州賽國生物科技有限公司;十二烷基硫酸鉀(potassium lauryl sulfate,PDS),國藥集團化學試劑有限公司;95%乙醇,巴斯夫生物科技有限公司;蒸餾水,邵陽學院實驗室提供;NaOH,上海巨鵬化工有限公司;半乳糖醛酸(98%),源葉生物有限公司;濃H2SO4,成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Haake RheoStress 6000流變儀、Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀、ST-16R高速冷凍離心機,Thermo Fisher Scientific公司;W201B旋轉蒸發儀,上海申勝生物技術有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司;TA-XT Plus物性測試儀,英國Stable Micro Systems有限公司;D/MAX2500V X射線衍射儀,日本理學株式會社;Gemini 500掃描電子顯微鏡,德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆腐柴果膠(AOP)凝膠的制備

根據PAN等[10]的方法,用草酸銨提取法提取AOP。首先,采用索氏提取法對新鮮豆腐柴粉末進行去色素、去脂肪處理。之后,粉末與95%體積分數乙醇按照料液比1∶30(g∶mL)進行混合,將懸浮液置于冰箱(4 ℃)中保存24 h,過濾后得到不溶性固體。將0.1 mol/L的草酸銨溶液加入不溶性固形物中[按料液比1∶30(g∶mL)],70 ℃加熱30 min。離心后(11 000 r/min,10 min,25 ℃),將上清液加入95%乙醇中(上清液與乙醇以1∶30 體積比混合),4 ℃保存24 h。隨后,收集固體,干燥后用超純水透析(48 h,分子截留量14 kDa)。透析液凍干過夜獲得AOP。另外,配制1 mol/L的KCl溶液。將AOP儲備液與KCl溶液按不同比例混合于10 mL體系的離心管中,來制備混合物(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L, K+體積分數為0.3% AOP),室溫靜置12 h后觀察其狀態,拍攝獲得直觀圖。

1.3.2 動態流變學測試

根據1.3.1節的方法制備了含不同K+濃度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L)的AOP凝膠。用流變儀在振蕩模式下對凝膠進行頻率掃描測量,從而獲得果膠凝膠的儲能模量(G′)和損耗角(tanδ=G″/G′)與振蕩頻率之間的變化關系。實驗參數設置為:平行板夾具(直徑35 mm,間隙1 mm),恒溫25 ℃,剪切應力0.1 Pa,頻率0.1～10 Hz。

1.3.3 凝膠硬度測試

在測試凝膠硬度之前,將含有不同K+濃度的AOP凝膠(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L),根據1.3.1節的方法在20 mL的玻璃樣品瓶(φ=27.5 mm,h=57.0 mm)中制備,使得凝膠高度約為10.0 mm。測試過程中,使用P/0.5圓柱形探頭進行硬度測試,允許以1.0 mm/s的速度壓縮凝膠至4.0 mm深度,施加5 g的觸發力[11]。每個凝膠制備3個樣本,每個樣本測試1次。

1.3.4 WHC測試

含不同K+濃度(0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L)的AOP凝膠WHC根據LI等[12]的方法測定。離心前稱取AOP凝膠的質量,稱取質量記為mt,離心后(10 000 r/min,10 min,25 ℃),稱量離心水,其質量記為mr。凝膠的WHC按公式(1)計算:

(1)

1.3.5 XRD測試

將AOP和冷凍干燥后的凝膠樣品置于XRD儀中分析,測試條件為:CuKα靶,掃描范圍2θ為5～60°,掃描速率2°/min。

1.3.6 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)測試

根據SONG等[13]的方法,采用SEM觀察凝膠微觀結構。按照1.3.1節的方法制備了不同K+濃度誘導的AOP凝膠后,再轉移至-80 ℃冰箱中冷藏12 h后,冷凍干燥12 h。將凍干后的凝膠噴金后,置于掃描電子顯微鏡中觀察,加速電壓為5.0 kV。在1 000倍下觀察每個樣品的顯微照片。采用XT Microscope Control軟件釆集圖譜。

1.3.7 FT-IR測試

稱取冷凍干燥后的AOP和AOP凝膠樣品1～3 mg進行KBr壓片,然后放入樣品池中,采用傅里葉紅外光譜儀進行掃描檢測,光譜范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1。

1.3.8 凝膠作用力測試

通過硬度測試和動態流變學測試,分析AOP與K+之間的凝膠作用力。將10 mol/L尿素、2%(體積分數)PDS兩種不同的解離試劑分別在AOP-K+凝膠配制的過程中加入。室溫靜置12 h后,流變學測量按1.3.1節和1.3.2節中的方法進行。

1.4 處理及分析

實驗數據以平均值±標準差形式表示。采用Origin 8.0軟件繪制圖表,利用LSD測試和SPSS 21.0軟件對數據進行方差分析(ANOVA)。P<0.05表示為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 AOP凝膠的可視化觀察和動態流變學研究

圖1展示了添加不同濃度的K+后,0.3%(體積分數)AOP溶液狀態的變化。在AOP溶液中,K+濃度為0.3 mol/L時發生聚集,但形成的聚集物掉入到了管底(圖1-b)。因此,此時AOP沒有形成堅固的凝膠。當K+濃度>0.4 mol/L時,AOP形成了堅固的凝膠。動態流變試驗常用來表征凝膠的形成,損耗因子tanδ可作為評估標準。當樣品的tanδ>1時,通常認為是液體;當試樣的tanδ<1時,一般認為它具有固體性質。tanδ值越小,說明凝膠的固體性質越高。

a-正立圖;b-倒立圖圖1 不同K+濃度下AOP凝膠圖Fig.1 Diagrams of AOP gel at different K+ concentration

如圖2所示,含0.3 mol/L K+時AOP的G′顯著低于其他樣品。另外,其tanδ≈0.7,高于其他凝膠。表明AOP在0.3 mol/L處形成的聚集體結構最弱。隨著K+濃度的增加,樣品的G′增大,在0.6 mol/L時達到最大值,同時,tanδ達到最低值,低于0.1。這表明,0.6 mol/L K+對AOP的凝膠化最有利,在此濃度下可以形成具有最高類固體性質的凝膠。K+誘導的AOP凝膠化可能歸因于K+的靜電屏蔽效應,這可能導致AOP鏈形成更多纏結,果膠鏈之間可能形成更多低鍵能相互作用,如氫鍵[14-15]。

a-G′;b-tanδ圖2 含不同K+濃度的AOP凝膠的G′和tanδFig.2 G′ and tanδ of the AOP gel with different K+ concentrations

2.2 凝膠硬度和WHC分析

如圖3所示,通過差異性分析,可以得到不同K+濃度對承壓力和WHC存在顯著差異性(P<0.001,t=7.356)、(P=0.001,t=6.847)。隨著K+濃度的增加,從0.4到0.6 mol/L凝膠硬度增加,在0.7 mol/L時下降,而AOP凝膠的WHC也有類似的變化趨勢(圖3)。AOP凝膠的最高WHC也出現在0.6 mol/L,這些結果與可視圖一致。由此可知,存在一個最佳的K+濃度,使得AOP凝膠的凝膠硬度和WHC最強。陳曄等[16]研究了單價陽離子對柑橘果膠凝膠硬度和WHC的影響,結果表明,存在一個最佳的K+濃度(0.8 mol/L)使得柑橘果膠形成具有最佳的凝膠硬度和WHC的凝膠。隨著K+的加入,果膠鏈之間的斥力減小使得果膠鏈之間的距離減小,為氫鍵提供了更多的結合區域,從而增強了凝膠結構,提高了凝膠硬度。同時,當形成更多的氫鍵時,更多的水會在凝膠網絡中纏結,增加了AOP凝膠的WHC。然而,由于維持凝膠結構需要足夠的靜電斥力,當K+濃度高于最佳濃度時,果膠鏈間斥力的進一步降低可能會降低凝膠結構的穩定性。因此,AOP凝膠的硬度和WHC會降低。

a-凝膠硬度;b-保水性圖3 含不同K+濃度的AOP果膠的凝膠硬度和保水性Fig.3 Gel hardness and water holding capacity of AOP pectin with varying K+ concentrations

2.3 XRD分析

如圖4所示,K+的加入對AOP的晶型結構有顯著的影響。從AOP的XRD圖譜(圖4-a)可以看出,有寬吸收峰,說明AOP具有非晶型結構。在所有的AOP凝膠中(圖4-b),AOP的2個特征峰消失了,又形成了新的峰,說明K+的加入會導致AOP形成新的晶體結構。此外,含有0.6 mol/L K+的凝膠具有最強的峰強度,而峰強度在0.7 mol/L處降低。這意味著在0.6 mol/L K+形成的凝膠比在0.7 mol/L K+形成的凝膠具有更有序的結構。董姬秀等[17]研究了K+濃度對涼粉單多糖-大豆分離蛋白復合凝膠的影響。他們發現,當K+含量較高時,復合凝膠的原始特征峰幾乎消失,并形成新的尖銳特征峰,這意味著會產生新的分子間相互作用。新晶體結構的形成可能是由于K+的靜電屏蔽作用,導致了AOP鏈的纏結。隨后,果膠鏈上未解離的羧基產生了更多的氫鍵,AOP發生了凝膠化。在這個過程中,可能會形成一個更有序的結構。但當K+的含量高于最佳濃度時,凝膠結構穩定下降,從而降低了AOP凝膠的規律性。

a-AOP;b-AOP凝膠圖4 AOP和在不同K+濃度下AOP凝膠的XRD圖Fig.4 XRD plot of AOP and AOP gel at different K+ concentrations

2.4 SEM分析

如圖5-a所示,在K+含量為0.4 mol/L時,AOP凝膠呈現出了較為疏松、多孔的凝膠網絡結構,凝膠網絡中的空隙較大。而隨著K+濃度增加到0.6 mol/L(圖5-c),AOP凝膠呈現出了更加致密、均勻、光滑的微觀結構,凝膠網絡中的空隙越來越小,說明鹽離子的增加,強化了AOP凝膠的結構。此外,隨著K+濃度的增加,凝膠表面出現的塊狀物質也隨著增多,當鹽離子濃度達到0.7 mol/L時,凝膠表面出現了大量的塊狀顆粒,這可能是由于AOP在較高濃度K+的誘導下,發生了較強的凝聚作用,從而隨機形成了大量不規則的聚集體。這種作用可能弱化了AOP凝膠的強度。

a-0.4 mol/L;b-0.5 mol/L;c-0.6 mol/L;d-0.7 mol/L圖5 在不同K+濃度下AOP凝膠的SEM圖Fig.5 SEM plots of the AOP gels at different K+ concentrations

2.5 FT-IR分析

a-AOP;b-AOP凝膠圖6 AOP和在不同K+濃度下AOP凝膠的FT-IR圖譜Fig.6 FT-IR profile of AOP and AOP gel at different K+ concentrations

2.6 凝膠作用力分析

在AOP凝膠的制備中加入尿素和PDS 2種解離劑,分別破壞氫鍵、疏水相互作用。制備的凝膠用于動態流變試驗。結果表明,尿素對AOP凝膠的影響最顯著(圖7),與對照組相比,含有尿素的樣品的G′明顯降低。同時,其tanδ明顯高于其他樣本,表明此樣品的類固體性質被大大削弱。含有PDS的凝膠樣品,其G′和tanδ沒有顯著的不同的控制。這些結果證實了氫鍵在AOP凝膠化過程中起著最重要的作用,而疏水鍵的作用很小。ZHOU等[20]研究了低甲氧基果膠的酸誘導凝膠化,他們發現,分子之間的氫鍵會促進低甲氧基果膠在酸性pH下(2.5)的凝膠化。由于AOP的酯化度很低,果膠上并沒有很多疏水區域。因此,果膠鏈之間的疏水相互作用受到很大限制。相反,AOP含有高含量的聚半乳糖醛酸,所以羧基廣泛分布在果膠鏈上。因此,當靜電斥力在AOP鏈之間減弱時,相鄰的未解離的羧基之間往往形成氫鍵,主導著AOP的凝膠化。因此,氫鍵可能是AOP凝膠化的主要作用力。

a-G′;b-tanδ圖7 包含不同的解離試劑(2 mol/L尿素和體積分數為0.4%PDS)的0.6 mol/L K+的AOP凝膠的G′和tanδFig.7 G′ and tanδ of a 0.6 mol/L K+ AOP gel containing different dissociation reagents (2 mol/L urea and 0.4% PDS)

2.7 凝膠機理分析

根據HUANG等[21]的研究,在常溫下鹽離子與pH對果膠的凝膠化起到了主導作用。鹽離子種類的不同會導致果膠形成凝膠的機理不同。一般來說,二價陽離子加入到低酯果膠中時,能夠通過結合解離的羧酸根基團,在相互靠近的果膠分子鏈的光滑區之間形成分子間的離子結合點[22]。另外,從構成凝膠的分形聚集體(絮凝體)的微觀動力學角度來說,當Ca2+濃度在臨界鹽濃度以上,絮凝體間通過相互連接形成反應受限的凝膠網絡結構,因此Ca2+介導的果膠凝膠使絮凝體間的交聯強于絮凝體內的交聯,使得凝膠處于“強交聯”狀態[23]。對于單價陽離子,K+誘導果膠形成凝膠的機理與二價陽離子不同,在高酯果膠進行去酯化的過程中,一定濃度的單價鹽離子的存在會使得果膠分子上解離的羧酸根基團會與單價陽離子結合,降低了靜電斥力,使得果膠的擴展度降低,之后K+會與羥基形成一定的靜電吸引作用,從而形成凝膠[24]。另外,有研究指出,對于低酯果膠,在較低pH下(2～4),一價離子的存在進一步降低了低酯果膠鏈間的電荷排斥,并通過氫鍵的作用形成凝膠[25-26]。pH的變化會導致果膠分子鏈的構象、結構發生變化,在較高pH下,果膠鏈的構象是高度伸展的,其局部幾何結構接近于二級有序結構,而隨著pH的降低,果膠的鏈構象將轉換成可逆的更加緊實的三維結構。當pH達到果膠鏈幾乎不帶電的非常低的pH值時,果膠鏈會通過三倍螺旋的二聚作用形成凝膠[27]。在這個過程中,羧基基團會通過形成氫鍵來穩定凝膠結構。

基于上述討論和實驗結果,可以推斷出K+誘導AOP凝膠化的機理(圖8)。在AOP溶液中加入KCl溶液時,K+會與果膠鏈上游離的羧基結合,產生靜電屏蔽效應,從而降低了AOP分子內部和分子間的靜電斥力,降低了AOP的膨脹程度,使果膠分子相互靠近。同時,AOP分子內和分子間的氫鍵將通過果膠鏈上的羥基和未解離的羧基形成,從而導致果膠分子間的結合和凝膠的形成。此外,有一個最佳的K+濃度有助于AOP凝膠的最佳結構。當K+含量超過最佳濃度時,果膠分子間的靜電斥力將大大降低,AOP分子間的結合將更加強烈。在此過程中,果膠分子隨機聚集,大大降低了凝膠結構的有序性和強度。

圖8 K+誘導豆腐柴果膠自凝膠Fig.8 K+ induced P.microphylla pectin self-gel

3 結論

本研究對K+誘導AOP凝膠化進行了研究,證明了K+濃度對AOP凝膠的形成有決定性的影響。此外,K+誘導AOP凝膠化主要是由靜電屏蔽和氫鍵引起的,0.6 mol/L的K+濃度是AOP形成固體狀特征和穩定結構凝膠的最佳濃度,在AOP溶液中加入KCl溶液時,K+會與果膠鏈上游離的羧基結合,產生靜電屏蔽效應,從而降低了AOP分子內部和分子間的靜電斥力,降低了AOP的膨脹程度,使果膠分子相互靠近。同時,AOP分子內和分子間的氫鍵將通過果膠鏈上的羥基和未解離的羧基形成,從而導致果膠分子間的結合和凝膠的形成。當K+濃度高于最適濃度時,果膠分子強烈聚集導致了凝膠強度和穩定性的降低,使得其凝膠性能降低。