松鼠大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌混合感染的病原鑒定及診治

孫 寧，修福曉，李新鳴，張加鑫，郞文萱，徐 澍，俞 曦，周媛婷，榮勤雙，孟奕祥，范本旭，曲藝?guó)Q，朱啟文

（1.中國(guó)刑事警察學(xué)院，沈陽，110048；2.沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省行為認(rèn)知重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽，110034；3.安徽省銅陵市公安局，銅陵，244000；4.上海市公安局刑事偵查總隊(duì)警犬隊(duì)，上海，201799）

近幾年，松鼠（Sciurus vulgaris）成為新興異寵，因其溫馴可愛、小巧便攜和干凈衛(wèi)生，越來越受歡迎。但由于松鼠人工馴養(yǎng)時(shí)間較短，對(duì)其品種、飼養(yǎng)條件、行為、疾病防治和健康福利知之甚少［1］。松鼠的臨床癥狀不易被察覺，診斷難度大，患病松鼠來不及治療會(huì)出現(xiàn)急性死亡。d’Ovidio 等［2］調(diào)查統(tǒng)計(jì)，63% 松鼠會(huì)有健康問題，尤其是皮膚病（52%）和腸道疾病（34%）。本文報(bào)告1 例松鼠大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）混合感染的病原鑒定及診治過程，現(xiàn)將情況匯報(bào)如下。

1 臨床癥狀

2021 年12 月，沈陽某學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心6 只籠養(yǎng)用于搜索毒品訓(xùn)練的松鼠，初期有1 只突發(fā)性死亡，其他松鼠陸續(xù)表現(xiàn)為腹瀉、食欲減退和精神沉郁等癥狀，由正常糞便狀態(tài)（灰黑色，顆粒狀或短條狀、兩端尖）變?yōu)檐洷悖ú怀尚危S色）至水樣便（水樣，深黃綠色或黑色，惡臭，伴有膿液）（圖1）。

圖1 發(fā)病與病死松鼠的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of the sick and dead squirrel

2 病史調(diào)查

松鼠為魔王松鼠（Sciurus vulgaris，1758）［3］，購(gòu)自黑龍江松鼠養(yǎng)殖基地（黑龍江省伊春）。6 只，2 歲，雄性，體質(zhì)量390～550 g。松鼠在動(dòng)物中心已人工飼養(yǎng)1年半，每只松鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于78 cm×51 cm×132 cm的3 層大籠中，松鼠的飼料包括榛子、小油葵花子、松子、梨和蘋果等。松鼠每日進(jìn)行搜索毒品訓(xùn)練，每日食物量為85 枚小油葵花子及5 枚榛子或松子，約100 g。飲水潔凈。每周喂食紅狗營(yíng)養(yǎng)膏（RedDog）5 g，用以提供21 種維生素和18 種氨基酸均衡營(yíng)養(yǎng)。

3 剖檢結(jié)果

將發(fā)病死亡松鼠剖檢（圖2），肛周無殘留糞便，解剖后可見胃部脹大、胃內(nèi)有大量脹氣；腸壁變薄，回腸段的腸黏膜充血，盲腸段有脹氣，盲腸段腸黏膜呈灰黃色，結(jié)腸段腸黏膜呈黑綠色，結(jié)腸、直腸內(nèi)容物幾乎無固體糞便，只有大量蛋花狀水樣便，腸淋巴結(jié)腫大出血；肝淤血、腫大；膀胱充盈；其他器官未見明顯病變［4-5］。

圖2 病死松鼠的剖檢結(jié)果Fig.2 Autopsy results of the dead squirrel

4 細(xì)菌分離鑒定

無菌采集死亡松鼠的糞便、盲結(jié)腸內(nèi)容物及其余5只松鼠的糞便，將標(biāo)本分別接種5種選擇鑒別培養(yǎng)基：血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基及甘露醇高鹽培養(yǎng)基，對(duì)腸道菌進(jìn)行初次分離培養(yǎng)、2 次分離培養(yǎng)以篩選出不同細(xì)菌，3 次分離培養(yǎng)以鑒別腸道菌，最后挑取部分菌落涂于載玻片進(jìn)行革蘭氏染色。

觀察菌落特征（圖3），血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)結(jié)果為2 種顏色、形態(tài)和大小不同的菌落，并經(jīng)過血平板2 次分離培養(yǎng)（圖4）；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結(jié)果為1 種菌落，菌落中心呈暗藍(lán)黑色，發(fā)金屬光澤，為大腸埃希氏菌；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結(jié)果為1 種菌落，菌落呈粉紅色，不透明，為大腸埃希氏菌；沙氏瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結(jié)果為2 種顏色、形態(tài)和大小不同的菌落；甘露醇高鹽瓊脂3次分離培養(yǎng)結(jié)果為1種菌落，黃色，不透明，為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或松鼠葡萄球菌（圖5）。

圖3 初次分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.3 Results of the first bacterial isolation and culture

圖4 血平板2次分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.4 Results of the second bacterial isolation and culture in the blood agar

圖5 甘露醇高鹽瓊脂3次分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.5 Results of the third bacterial isolation and culture in the Mannitol salt agar

經(jīng)過細(xì)菌分離形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果，初步判斷為大腸埃希氏菌（可能為致病性菌株）、金黃色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌（圖6）。

圖6 革蘭氏染色結(jié)果（100×）Fig.6 Gram staining result（100×）

5 細(xì)菌16S rDNA基因檢測(cè)

取菌落培養(yǎng)的平板，按Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒（SK8255）操作抽提DNA。細(xì)菌16S rDNA 通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 500 bp。引物信息見表1。PCR 總反應(yīng)體系為25.0 μL：正、反引物各1.0 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，按照SanPrep 柱式DNAJ 膠回收試劑盒（SK8131）操作，將PCR 產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA 目的條帶回收，PCR 產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primer information

利用特異性引物分別對(duì)從糞便、腸道中分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，細(xì)菌16S rDNA 基因擴(kuò)增結(jié)果顯示得到大小為1 475～1 487 bp的特異性片段，長(zhǎng)度與預(yù)期相符（圖7）。

圖7 分離菌16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Amplification of 16S rDNA of isolated bacteria by PCR

將測(cè)定的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，以此來鑒定細(xì)菌種屬。測(cè)序后比對(duì)結(jié)果顯示：分離菌株的基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已上傳的LS483305.1等10 種松鼠葡萄球菌參考株相應(yīng)序列同源性均為100%，與CP072688.1 等10 種大腸埃希氏菌參考株相應(yīng)序列同源性均為99.93%。由此，綜合分離菌的形態(tài)學(xué)特征、革蘭氏染色及16S rDNA 基因測(cè)序分析，確定該分離菌為松鼠葡萄球菌和大腸埃希氏菌。

6 大腸埃希氏菌血清型測(cè)定

將分離純化的大腸埃希氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，濃縮菌液，115 ℃高壓制成菌體抗原。大腸埃希氏菌O抗原診斷血清購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司，按使用說明書進(jìn)行抗原-抗體平板凝集試驗(yàn)，鑒定本次分離到的大腸埃希氏菌血清型為O2型。

7 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取分離到的單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。吸取一定量的菌液涂布于固體培養(yǎng)基，用無菌鑷子將14種藥敏紙片貼于固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）≥15 mm為敏感，10 mm≤D＜15 mm為中介，D＜10 mm為耐藥。

用于大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌的藥敏紙片的種類包括氨芐西林、頭孢唑啉、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、阿米卡星、恩諾沙星、氯霉素、克林霉素（氯潔霉素）和頭孢克肟，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：大腸埃希氏菌對(duì)頭孢克肟、慶大霉素和卡那霉素等9 種抗生素敏感，對(duì)磺胺嘧啶耐藥；松鼠葡萄球菌對(duì)頭孢克肟、頭孢唑啉和氨芐西林等8 種抗生素敏感，對(duì)卡那霉素、諾氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥（表2）。

表2 分離菌株對(duì)14種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of drug susceptibility test of isolated strains to 14 antibiotics

8 診治措施及效果

8.1 藥物治療

如果松鼠糞便為水樣，口服頭孢克肟顆粒，每日50 mg，兌水，松鼠自行飲用。因頭孢克肟具輕微特異臭氣味［6］，松鼠嗅覺靈敏，有的松鼠排斥，可將頭孢克肟顆粒配合其喜歡的食物喂食，連用3～5 d。如果松鼠糞便為黃軟便樣，口服乳酸菌素顆粒，每次2 g，2 次/d，兌水或舔服。連用2 d，如果糞便還未成形，立即改為使用頭孢克肟顆粒。

8.2 外部消毒

籠子、飲食用具使用次氯酸鈉噴灑，消毒1次/d；徹底清理糞便，飲水換為涼白開或純凈水。

8.3 清理殘留貯存

在腹瀉期間，忌食用油性大的食物，如松子，會(huì)影響治療效果。松鼠有貯存食物習(xí)性，平日會(huì)將松子埋藏在籠子的角落，需要將松鼠的貯存徹底清理。

經(jīng)上述綜合防治措施，2 d 后未有新發(fā)病例，已發(fā)病松鼠糞便狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常，5 d 后全部恢復(fù)正常。

9 討論

人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到微生物群可以反映動(dòng)物的健康狀況，也可以衡量圈養(yǎng)對(duì)野生物種生存的影響。細(xì)菌感染性疾病不僅與病原微生物有關(guān)，還源于微生物群落內(nèi)常駐菌群的失調(diào)［7］。圈養(yǎng)會(huì)對(duì)野生物種的微生物菌群產(chǎn)生重大影響，減少其豐度并導(dǎo)致菌群失衡。Olah 等［8］研究表明，有30%圈養(yǎng)環(huán)境下長(zhǎng)大的松鼠，在重置新環(huán)境后會(huì)發(fā)生不明原因死亡，野生和圈養(yǎng)兩種不同生活環(huán)境下，松鼠的微生物群總體相似，這種微小的差異有利于圈養(yǎng)松鼠。在圈養(yǎng)條件下，松鼠的日糧種類需要接近于野外生活條件的飲食以平衡菌群。野外環(huán)境中，松鼠主要取食針葉樹種子、榛子、橡子等。當(dāng)食物資源缺乏時(shí)，松鼠也取食蘑菇及其他真菌類食物、鳥類的卵、昆蟲、植物的花和嫩芽等［9］。根據(jù)松鼠養(yǎng)殖的經(jīng)驗(yàn)，松鼠在腹瀉康復(fù)期也可以多食用蘑菇等。

采用分子生物學(xué)手段對(duì)分離菌16S rDNA 序列進(jìn)行鑒定很有必要。在細(xì)菌基因組中，16S rDNA 基因普遍存在，功能穩(wěn)定，高度保守，不易發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，已成為細(xì)菌分類鑒定的重要分子標(biāo)記［10］。本報(bào)告中松鼠的發(fā)病原因確認(rèn)為大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌混合感染，致病菌混合感染時(shí)所引起的臨床癥狀和病理特征既具有廣泛性，又具有復(fù)雜性，單憑臨床觀察、病理剖檢，甚至細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)鑒定也難以準(zhǔn)確判斷致病原。在本試驗(yàn)中，最初認(rèn)為甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基是金黃色葡萄球菌的選擇性培養(yǎng)基［11］，但松鼠葡萄球菌的生化特征在10%NaCl 瓊脂上生長(zhǎng)良好，對(duì)甘露醇發(fā)酵反應(yīng)呈陽性［12］，可見金黃色葡萄球菌和松鼠葡萄球菌的生化特征都耐高鹽且能在甘露醇中發(fā)酵，因此本研究中分離菌種在甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果可能為葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）中的金黃色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌。再通過擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 基因測(cè)序進(jìn)行鑒定，經(jīng)BLAST 比對(duì)，進(jìn)一步確定該菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的松鼠葡萄球菌具有很高的相似性。因此，在傳統(tǒng)的細(xì)菌形態(tài)、生化實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上還需要通過16S rDNA 基因序列分析鑒定才能得到精準(zhǔn)的鑒定結(jié)果。

關(guān)于松鼠葡萄球菌的報(bào)道不多，松鼠葡萄球菌是最古老的葡萄球菌之一，它一般存在于寵物、野生動(dòng)物的皮膚和黏膜表面，最早是1976 年由Kloos等［13］報(bào)道，從東部灰松鼠（Sciurus carolinensis）、南方鼯鼠（Glaucomys volans）、負(fù)鼠（Didelphis virginiana）、浣熊（Procyon lotor）、犬（Canis familiarus）、綿羊（Ovis aries）和人類身上被分離出。Duff 等［14］報(bào)道了松鼠在傳染痘病毒（Poxviral）后，在眼睛和腸道上繼發(fā)了松鼠葡萄球菌感染。與金黃色葡萄球菌不同，松鼠葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌，對(duì)新生霉素天然耐藥，氧化酶反應(yīng)陽性，這是松鼠葡萄球菌的主要生化特征。作為條件致病菌，在不利因素下，松鼠葡萄球菌可引起心內(nèi)膜炎、膿毒血癥休克和尿路感染，最常見的為傷口感染［15］。

本研究中鑒定的大腸埃希氏菌血清型是O2型，為致病型大腸埃希氏菌。已在雞、豬、牛和中華竹鼠（Rhizomys sinensis）等多種動(dòng)物中分離到該型大腸埃希氏菌［16-18］。在3 例松鼠致命性壞死性腸炎病例中發(fā)現(xiàn)了溶血型大腸埃希氏菌，同時(shí)檢測(cè)到腺病毒1 型［19］。從英國(guó)野外回收的松鼠尸體中鑒定出非溶血型大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌［20］。O2型大腸埃希氏菌臨床上引起上述動(dòng)物的主要癥狀有腹瀉、腹疼、子宮內(nèi)膜炎和體溫升高等，可引起心臟、腎臟和肝臟等多個(gè)器官的病變或損傷。

以往研究中，大腸埃希氏菌具有較高的耐藥性，尤其是醫(yī)院分離到的大腸埃希氏菌耐藥現(xiàn)象更普遍，主要機(jī)制包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）耐藥機(jī)制、CTX-M基因型耐藥機(jī)制和AmpC 酶耐藥機(jī)制［21-23］。本研究分離到的大腸埃希氏菌對(duì)頭孢克肟、慶大霉素和鏈霉素等9 種藥物具有較高的敏感性，僅對(duì)磺胺嘧啶耐藥，這與以往研究具有一定差異。這可能是因?yàn)樗墒篑Z化時(shí)間短，某些生物特性仍與野生動(dòng)物具有較高的相似性，如郭定宗等［24］研究表明野生動(dòng)物的大腸埃希氏菌具有較低的耐藥性。從發(fā)病雞體內(nèi)分離得到的3 株松鼠葡萄球菌對(duì)多西環(huán)素、阿莫西林和環(huán)丙沙星等藥物敏感［25］。1 株奶牛源松鼠葡萄球菌的分離菌株對(duì)復(fù)方新諾明、氨芐西林等7種藥物敏感，對(duì)克林霉素、頭孢噻肟和頭孢呋辛中度敏感，對(duì)青霉素、紅霉素和林可霉素耐藥［12］。本研究分離到的松鼠葡萄球菌對(duì)頭孢克肟、頭孢唑啉和氨芐西林等敏感，對(duì)卡那霉素、諾氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥，與上述研究結(jié)果略有不同，可見，不同松鼠葡萄球菌菌株對(duì)藥物有不同程度的敏感性。試驗(yàn)中分離到的大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌均對(duì)頭孢克肟、鏈霉素、阿米卡星和恩諾沙星敏感，上述藥物可以作為首選臨床用藥。本病例中首選了松鼠養(yǎng)殖場(chǎng)的常用藥——頭孢克肟，其對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌有廣譜抗菌作用［6］。

Olah等［8］在2022年首次報(bào)道了健康松鼠的正常菌群微生物群落，包括18 個(gè)種和8 個(gè)不同屬的62 個(gè)細(xì)菌菌株，無論是野生還是圈養(yǎng)條件下，松鼠發(fā)病率最高的都是松鼠葡萄球菌（60%），其次是大腸埃希氏菌（45%）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus，35%）。可見，大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌是存在于松鼠等多種宿主體內(nèi)的病原體。本研究中的病原也為大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌，可能來源于被細(xì)菌污染或變質(zhì)的食物。松鼠膽小敏感，好躲避人，發(fā)病時(shí)不易被察覺，且病程短，致死率高，所以在日常中應(yīng)以預(yù)防為主，加強(qiáng)管理，保證食物干凈新鮮衛(wèi)生，嚴(yán)禁飼喂發(fā)霉變質(zhì)飼料，同時(shí)對(duì)圈舍、飲食器具進(jìn)行清潔和消毒，保持潔凈和干燥，提高松鼠的生活環(huán)境質(zhì)量，預(yù)防疫病發(fā)生。