鴨坦布蘇病毒感染誘導禽巨噬細胞M1 型極化

耿寧蔚，郭志云，呂澤昊，李 靖，李 寧

（山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271000）

隨著規模化養鴨場的迅速擴張，鴨傳染病的發病率越來越高，這不僅損害了養鴨業的發展，而且部分疾病還可能會對公共健康造成一定威脅[1]。鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）自2010 年暴發以來，該病已經成為嚴重危害養鴨業的重大疫病之一。DTMUV 感染產蛋鴨，導致卵巢出血，產蛋量急劇下降，它還會導致雛鴨發熱、生長遲緩和神經癥狀[2]。有報道顯示，養殖場工作人員可攜帶DTMUV 抗體，且該病毒可感染人神經細胞，因此，深入研究該病的致病機制，不僅有利于保障養鴨業的健康發展，還具有非常重要的公共衛生意義[3]。

巨噬細胞是廣泛分布于全身血液和組織的免疫細胞，作為抵抗微生物感染的第一道防線之一，它們通過分泌大量的細胞因子來促進和協調宿主免疫[4]。極化對巨噬細胞的生物功能至關重要，而巨噬細胞極化在炎癥發展中非常重要。在不同外界刺激下，巨噬細胞極化可分為兩種類型：經典激活的巨噬細胞（M1）和交替激活的巨噬細胞（M2）。M1 型巨噬細胞可產生大量促炎癥細胞因子，如TNFα、IL-6、CXCL-8 和IL-1β，在促炎癥、組織損傷、抗腫瘤和防腐方面起作用，主要參與Th1 型免疫反應。M2 巨噬細胞主要參與Th2 型免疫反應，發揮抗炎、組織修復和免疫調節作用[5]。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒

雞骨髓巨噬細胞系HD11 由上海諾萊生物技術有限公司提供。DTMUV FX2010 株（登錄號：MH414568.1）在BHK-21 細胞上進行增殖，并收集細胞上清用于后續實驗。

1.2 熒光定量PCR（qPCR）

用Trizol（TaKaRa，大連，中國）提取細胞樣本總RNA。使用HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）kit（諾唯贊，南京，中國）將100 μg 的總RNA 逆轉錄成cDNA 用于后續實驗。使用表1 中的引物進行qPCR 反應。qPCR 的體系為20 μL，具體包括1 μL cDNA（25 ng），上下游引物（10 μM）各 0.4 μL，10 μL SYBR Green 和3.2 μL 無菌水。反應條件為：95 ℃ 30 s 一個循環，然后40 個循環95 ℃5 s 和60 ℃ 30 s。

表1 引物序列

1.3 亞硝酸鹽檢測

用Griess 方法檢測細胞培養上清液中的亞硝酸鹽（M1 巨噬細胞產生的一氧化氮的穩定代謝物）的濃度。在本實驗中，細胞上清液中的一氧化氮濃度是用一氧化氮檢測試劑盒（Beyotime，上海，中國）測定。首先，取出Griess 試劑I 和II 讓其恢復到室溫。將標準物質（1～100 μM）用含10%FBS 的RPMI1640 細胞培養基稀釋。然后將標準物質和對照細胞培養上清液以50 μL/孔加入96 孔板中。在有樣品的孔中以50 μL/孔加入Griess Reagent I，在每個孔中以50 μL/孔加入Griess Reagent II。依次加入96 孔板后，靜置10 min，用酶標儀在540 nm 處測量吸光度。根據標準曲線計算樣品中一氧化氮的濃度。

1.4 流式細胞術

M1 型HD11 巨噬細胞的細胞表面分子用FITC 結合的抗雞MHC-II 抗體（abcam，英國）染色。用胰蛋白酶消化后收集細胞，然后用5%血清阻斷，使用抗體（1:500，批號ab24882）避光孵化，每一步前后樣品經PBS 洗滌，最后用500 μL PBS 重新懸浮細胞，并立即用 LSR Fortessa 流式細胞儀（BD Biosciences，美國）進行檢測。使用FlowJo 軟件（BD Biosciences，美國）對結果進行分析。

1.5 統計分析

qPCR 數據使用2-ΔΔct方法進行分析。從三個獨立實驗中獲得的數據以平均值±標準差（MEAN±SD）表示。使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software, San Diego, CA）進行數據的統計與作圖。兩組數據通過student’s t 檢驗進行差異性分析。*P<0.05 和**P<0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結果

2.1 qPCR 檢測DTMUV 感染后對HD11 巨噬細胞極化的影響

通過qPCR 檢測接毒和LPS 處理后不同時間點對HD11 巨噬細胞極化的影響，發現DTMUV感染巨噬細胞后對M1 型巨噬細胞極化標志因子，包括CXCL-8、IL-1β、iNOS、CD86 等具有顯著誘導作用，并且上調倍數高達1 500 多倍，而對M2 型極化標志因子，如IL-10、IL-4、CD206 等激活作用較弱。結果初步表明，DTMUV 感染誘導HD11 巨噬細胞發生M1 型極化（圖1）。

圖1 qPCR 檢測接毒后HD11 細胞M1 和M2 極化相關因子

2.2 M1 型巨噬細胞極化關鍵因子iNOS 的檢測

通過2.1 的結果分析表明，DTMUV 主要引起HD11 巨噬細胞發生M1 型極化，所以進一步驗證DTMUV 感染后對M1 型巨噬細胞極化關鍵因子iNOS 的影響。由于一氧化氮并不穩定，其會代謝為亞硝酸鹽，所以對亞硝酸鹽的濃度進行檢測。結果表明，DTMUV 感染HD11 巨噬細胞后亞硝酸鹽濃度顯著升高（圖2）。

圖2 DTMUV 感染HD11 巨噬細胞后亞硝酸鹽濃度檢測

2.3 M1 型巨噬細胞關鍵因子MHC-Ⅱ的檢測

通過流式細胞術進一步檢測DTMUV 感染后對M1 型巨噬細胞極化相關特征因子MHC-Ⅱ的影響。結果發現，在DTMUV 感染后3 h 就顯著激活MHC-II 的表達，表明病毒能有效激活禽巨噬細胞的M1 型極化。

3 討論與結論

多項研究報道，禽巨噬細胞是DTMUV 感染的關鍵靶細胞，被感染的巨噬細胞對DTMUV 的復制、傳播和致病機制至關重要[6]。此外，巨噬細胞在病毒感染情況下會發揮不同功能作用，不僅有利于抵抗病毒，還有可能促進病毒復制和傳播[7]。特別是病毒感染后激活M1 型巨噬細胞極化，可能引起細胞因子風暴，對宿主造成炎癥損害[8]。首先通過熒光定量PCR 檢測了DTMUV 感染后對M1 和M2 巨噬細胞極化相關因子的影響，發現DTMUV 感染HD11 巨噬細胞后主要激活M1 型極化相關因子的表達。文獻報道，亞硝酸濃度檢測可以作為極化檢測標準[9]，通過亞硝酸檢測試劑盒進一步檢測了DTMUV 感染HD11巨噬細胞后亞硝酸鹽的含量，發現病毒感染顯著升高了亞硝酸鹽濃度，因亞硝酸鹽是一氧化氮的穩定代謝物，因此亞硝酸鹽濃度的檢測作為M1型巨噬細胞檢測指標，亞硝酸鹽濃度的升高表明，DTMUV 感染后顯著誘導M1 型巨噬細胞極化。MHC-Ⅱ是巨噬細胞極化后激活產生的細胞表面因子[10]，通過流式細胞術檢測MHC-Ⅱ的表達，發現DTMUV 感染HD11 細胞后從3 h 就顯著誘導MHC-Ⅱ的表達。

綜合上述結果分析表明，鴨坦布蘇病毒感染HD11 細胞后3 h 就可以誘導巨噬細胞發生M1 型功能極化，并產生大量炎性因子，為后續實驗闡明極化分子機制鑒定基礎。