生物法調控右旋糖酐分子量的研究進展

相萍萍

（上海健康醫學院附屬衛生學校（上海健康護理職業學院（籌）），上海 200237）

右旋糖酐（Dextran）是一種微生物多糖，分子式為(C6H10O5)n，是由α-D-葡萄糖基聚合而成的高分子量同多糖，因為右旋糖酐聚合度的差別，所獲得的右旋糖酐的分子量也不盡相同，不同分子量的右旋糖酐在食品行業有不同的應用。重均分子量在1×106～2×106的高分子量右旋糖酐可以作為食品添加劑使用，添加到面包中可增加柔軟度、增大體積、改善面包的質地[1]；還可以用于果糖糖漿以及糖果中阻止蔗糖結晶[2]。重均分子量在1×105～1×106的右旋糖酐可用作糕點和飲料中的增稠劑、保濕劑和乳化劑等[3]；重均分子量小的右旋糖酐還可以作為益生元，作為人類和動物食品的營養添加劑[4]。傳統自然發酵法生產的右旋糖酐不僅黏度大，而且分子量太高，為了得到特定分子量的右旋糖酐，需要將分子量高的右旋糖酐進行調控降解。本文綜述了生物法調控右旋糖酐分子量的研究進展。

1 發酵法

合成右旋糖酐所用的菌株主要是明串珠菌和鏈球菌，所選擇使用的菌株不同，合成的右旋糖酐的分子結構也有所差異。腸膜明串珠菌是當前合成右旋糖酐最常用的菌株。右旋糖酐主要是以蔗糖為底物，經腸膜明串珠菌發酵而合成，合成原理為腸膜明串珠菌分泌合成酶右旋糖酐蔗糖酶到細胞外，右旋糖酐蔗糖酶會進一步催化蔗糖生成D-葡萄糖基，并將生成的D-葡萄糖基轉移到糖鏈上聚合形成分子量不同的右旋糖酐。

1.1 單一菌株發酵法

傳統的單一游離菌株發酵法是通過優化培養基，控制反應條件如底物（蔗糖）濃度、接種量、發酵時間等合成一些中小分子量的右旋糖酐。但是這種方法的合成反應終體系的黏度較大，很難實現右旋糖酐的分離純化，且右旋糖酐的產量及質量的穩定性較差。此外，發酵培養基如蛋白胨、牛肉膏、無機鹽等可能未反應完全，體系中會有部分殘留，導致雜質較多，且發酵時間較長，目標產物得率較低。

有文獻報道[5]，游離菌產生的右旋糖酐的分子量更接近于藍色葡聚糖的分子量（200 萬），遠大于固定化菌生成的右旋糖酐的分子量。QADER 等[6]利用海藻酸鈣固定化菌發酵生產右旋糖酐，通過對右旋糖酐分子量及分子量分布的研究發現，固定化菌產生的右旋糖酐的相對分子質量為50 000。王清等[7]調控發酵培養基中碳源與氮源的含量發現，當培養基中其他條件不變時，增大碳源以及氮源的含量，合成的右旋糖酐分子量（百萬數量級）增大，因此可以通過適當調整碳源與氮源的含量調控右旋糖酐的分子量。

采用固定化微生物技術，利用化學或物理手段將發酵生產右旋糖酐的菌株固定在一塊特定的微小區域內或附著于某一塊載體上進行固定化，可以得到固定化菌。固定化菌發酵法對右旋糖酐分子量控制比游離菌發酵法更顯著，固定化菌的保存時間相對較長，并且對外界環境的耐受能力強，且固定化菌可重復使用。但是，固定化后的菌體活性下降，發酵生成的大分子右旋糖酐會存在固定化小球內或依附于小球表面，黏度較大，容易和固定化菌纏繞在一起，從而堵塞固定化小球的孔徑，使大分子右旋糖酐無法及時從固定化小球中擴散出去。大分子右旋糖酐在小球內不斷堆積，最后使固定化小球溶脹破裂。

1.2 雙菌株發酵法

雙菌株發酵法生產特定分子量的右旋糖酐是通過在含蔗糖的發酵體系中加入兩種菌種的種子發酵液，一種菌株能催化蔗糖生成右旋糖酐，另一種菌株能夠產生分解酶分解大分子右旋糖酐，通過調控發酵工藝條件如發酵溫度、時間、pH 值、兩種菌株混合發酵時間、兩種菌株種子發酵液的加入比例等，調控合成分子量不同的右旋糖酐，控制效果明顯優于單菌株發酵法。

KIM 等[8]將腸膜明串珠菌與斯達式油脂酵母混合發酵，通過研究培養基成分、兩種菌株的種子培養液的加入比例、pH 值以及溫度，在最優反應條件下合成了重均分子量為75 000 的右旋糖酐；廖安平等[9]通過向含蔗糖的培養基中加入腸膜明串珠菌以及圓弧青霉菌種子培養液混合發酵，調控發酵條件，最終獲得產物中重均分子量為40 000 的右旋糖酐占80%。曹研研[10]研究了產分解酶右旋糖酐酶的棘孢青霉菌和右旋糖酐蔗糖酶的腸膜明串珠菌聯合發酵對右旋糖酐分子量控制的影響，發現順序發酵法對分子量的控制效果比混合發酵法好，右旋糖酐重均分子量能較好地控制在5 000 ～10 000。

相比傳統的單一菌株發酵法，雙菌株發酵體系中多加入了一種能產生右旋糖酐酶的菌株，右旋糖酐酶分解體系中右旋糖酐蔗糖酶合成的大分子右旋糖酐向目標分子量片段的藥用右旋糖酐集中，此方法能較好地實現特定分子量右旋糖酐的定向合成，但反應體系較復雜，產物中仍有未反應完全的雜質，仍需要用有機試劑輔助分離。

2 酶法

酶法合成右旋糖酐需要先分離、提純特定的細菌發酵分泌的合成右旋糖酐的合成酶 ——右旋糖酐蔗糖酶，然后利用右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐。相對于傳統的微生物發酵法，酶法反應條件更加穩定，對右旋糖酐分子量的定向控制效果更顯著。酶法合成的目標分子量右旋糖酐的均一度好、產物純度高，且反應體系更加簡單，沒有發酵培養基等雜質的干擾，易于提取精制，更有利于進一步探索特定分子量右旋糖酐合成過程中的機理研究。酶法通常可以分為單酶法和雙酶法。

2.1 單酶法

單酶法根據酶在體系中的狀態可以分為游離酶法和固定化酶法。其中固定化酶是利用物理或化學方法，將游離酶封鎖在固體材料或將其限制在某一區域內。王曉[11]和鄒青松[12]分別利用固定化右旋糖酐蔗糖酶和游離右旋糖酐蔗糖酶，通過控制蔗糖濃度、發酵時間以及催化反應中右旋糖酐蔗糖酶的濃度等反應條件，調控發酵產物中不同分子量葡聚糖的含量。但是這兩種方法生成的右旋糖酐重均分子量多集中在重均分子量大于1×106和重均分子量小于1×104的區域。

此外，與游離酶法相比較，固定化酶具有回收方便、相對穩定性高、可重復利用等優點，且采用固定化酶法可以減少體系的復雜程度，但是同時也存在一些弊端。①利用傳統腸膜明串珠菌產生提取的右旋糖酐蔗糖酶的酶活相對較低，固定化后會使右旋糖酐蔗糖酶的酶活進一步損失；②固定化酶應用于大分子的合成，容易使固定化孔徑阻塞，大分子不能及時排除，容易造成固定化小球溶脹破裂。

2.2 雙酶法

在單合成酶右旋糖酐蔗糖酶體系中加入分解酶右旋糖酐酶，可以有效調控產物分子量的分布，大大提高中小分子量片段右旋糖酐的得率。右旋糖酐酶能專一性地水解α-1,6 糖苷鍵，將大分量的右旋糖酐水解成較小分子量的右旋糖酐。雙酶法是在以蔗糖為底物的體系中加入兩種酶：右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶協同催化合成右旋糖酐，右旋糖酐蔗糖酶不斷合成大分子量的右旋糖酐，而右旋糖酐酶又可以對生成的大分子右旋糖酐進行降解，兩種酶相互作用，對右旋糖酐分子量的控制效果顯著。

GAN 等[13]以蔗糖為底物，在游離態右旋糖酐蔗糖酶催化生成右旋糖酐過程中，加入游離右旋糖酐酶，通過調控右旋糖酐酶的添加量以及添加時間，可以合成分子量不同的右旋糖酐，且產物中小分子量片段的右旋糖酐含量顯著提高，但是仍然存在一些中等分子量的副產物。張義平[14]以蔗糖為底物，通過優化固定化右旋糖酐蔗糖酶和固定化右旋糖酐酶的雙酶酶活比、底物濃度以及右旋糖酐蔗糖酶的總酶活量等反應條件制備右旋糖酐，獲得平均相對分子質量小于10 萬的右旋糖酐的比例達到99.95%，其占比遠高于單酶法。

綜上，雙酶法對右旋糖酐分子量的控制效果好，小分子右旋糖酐得率高，且對環境友好。但由于未經修飾或改造的右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且酶的活力與其催化能力密切相關，需要進一步構建工程菌或者馴化生產出右旋糖酐蔗糖酶酶活高的菌株，繼續研究在高酶活作用下右旋糖酐定向合成作用機制。

3 結語

右旋糖酐是一種具有高附加值的多糖，在食品行業有廣闊的市場前景。國內傳統右旋糖酐的制備方法大多為先合成再水解，所得產品的分子量不易控制，分子量分布均一性差、含雜質多，且在化學降解過程容易破壞活性基團并引入有害物質。近年來，隨著糖生物學研究的發展，很多研究者將制備特定分子量右旋糖酐方法聚焦于雙酶合成法，通過調控雙酶體系中底物濃度、右旋糖酐蔗糖酶加入量以及右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶的雙酶酶活比等，合成不同分子量的右旋糖酐。當前雙酶法調控制備特定分子量的右旋糖酐條件溫和、污染少、能耗低，目標分子量的右旋糖酐得率高，在保證產品質量的同時，降低了右旋糖酐生產成本，具有較好的應用前景。但是右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且其分離及質控較難，相信隨著酶工程、基因工程及分離純化等技術的不斷發展，將進一步提高特定分子量右旋糖酐的生產效率。