右美托咪定預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

楊雪兒，吳明瀟，張超凡，賈雋文，胡春陽(yáng)，溫立勇，李罡，金蓮錦

1 牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000；

2 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科；3 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院骨外科

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（CAD）是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，主要病理表現(xiàn)為缺血再灌注引起的心肌損傷。目前，尚無(wú)有效的治療方法來(lái)保護(hù)心臟免受心肌缺血再灌注損傷（MIRI），因此有必要尋找預(yù)防MIRI 的新策略，以改善CAD 患者的臨床結(jié)局。右美托咪定（Dex）是α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜作用；近期研究發(fā)現(xiàn)Dex可以通過(guò)多種途徑緩解包括心臟在內(nèi)的重要器官缺血再灌注損傷［1］。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）激活的交換蛋白分子Epac1是cAMP的直接靶向蛋白，通過(guò)激活Ras 蛋白家族成員Ras 樣小GTP 酶Rap1，促進(jìn)Rap1上無(wú)活性的GDP轉(zhuǎn)換為具有活性的GTP，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)功能［2］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Epac1信號(hào)通路被激活時(shí)，大鼠慢性MIRI 加重，并增加了大鼠心肌梗死面積，推測(cè)其機(jī)制與Epac1/Rap1信號(hào)通路的抗氧化作用有關(guān)［3］。基于此，本研究于2022年9月—2023 年3 月觀察了Dex 預(yù)處理對(duì)大鼠MIRI 的影響并通過(guò)Epac1 拮抗劑ESI09 阻斷Epac1/Rap1 信號(hào)通路，分析該機(jī)制是否與氧化應(yīng)激反應(yīng)及Epac1/Rap1信號(hào)通路有關(guān)，以期為Dex 在CAD 中的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康成年SD 雄性大鼠32 只，體質(zhì)量225～265 g，購(gòu)自牡丹江醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（黑）2019-003，符合中國(guó)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。大鼠均飼養(yǎng)在21～25 ℃鼠舍，相對(duì)濕度45%～55%，相同光照下自由飲水、進(jìn)食。Dex（批號(hào)：22022317，四川美達(dá)康華康公司），Epac1 拮抗劑ESI09（批號(hào)：263707-16-0，美國(guó)Selleck 公司），Epac1、Rap1 蛋白（批號(hào)：A4149、A0975，美國(guó)ABclonal 公司），蘇木素—伊紅（HE）染色劑（批號(hào)：C0107，Beyotime 公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA試劑盒（批號(hào)：23-03-01，北京誠(chéng)林生物公司），HX-300型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組及Dex 預(yù)處理 SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Dex組、抑制劑組，每組8只，大鼠禁食、禁水24 h。Dex 組在建模前30 min 腹腔注射Dex 25 μg/kg，抑制劑組在建模前30 min 及25 min 時(shí)分別給予Epac1拮抗劑ESI09 5 mg/kg［4］及Dex 25 μg/kg，假手術(shù)組、模型組在建模前30 min 給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 MIRI 模型建立 除假手術(shù)組外，各組均建立MIRI模型。通過(guò)腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，取仰臥位，進(jìn)行氣管插管，使用小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，監(jiān)測(cè)心跳以及心肌缺血開(kāi)始時(shí)的心電圖變化。按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行建模［5］，在大鼠左側(cè)胸骨約第4肋間打開(kāi)胸腔，找到心臟和血管，分離心包膜，結(jié)扎冠脈左前降支引起心肌缺血，心電圖表現(xiàn)為T(mén) 波高聳、ST 段明顯抬高及左心室尖和前壁變白提示心肌缺血模型制備成功。松開(kāi)結(jié)扎線進(jìn)行再灌注，持續(xù)2 h。心電圖顯示T 波恢復(fù)、ST 段下降50%及左心室尖和前壁變紅提示再灌注成功。假手術(shù)組胸腔暴露后，心臟僅穿線而不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。

1.4 心肌組織病理學(xué)觀察 采用HE染色。選取部分心肌組織，在4%多聚甲醛中固定24～72 h，脫水包埋切片，進(jìn)行HE 染色，封片后用帶有照相功能的光學(xué)顯微鏡觀察采集圖像，每張切片選擇2個(gè)視野。

1.5 血清心肌損傷及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法。取各組大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，靜置10 min，3 500 r/min離心15 min分離血清，放置于-80 ℃冰箱保存，按照ELISA試劑盒要求檢測(cè)血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD。

1.6 心肌組織Epac1/Rap1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組心肌組織20 mg，參照文獻(xiàn)［6］方法加入裂解液裂解研磨提取總蛋白，離心取上清液，測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%的封閉液室溫封閉2 h，加入Epac1、Rap1 及β-action 一抗稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天洗膜加入相應(yīng)二抗稀釋，室溫下?lián)u床中作用1 h，TBST 洗4 次，每次15 min，ECL 避光顯色2 min，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。以β-action作為內(nèi)參，以目的條帶與對(duì)照條帶灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 方法行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織病理學(xué)比較 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊、邊緣清晰，未見(jiàn)心肌纖維斷裂和細(xì)胞間質(zhì)腫脹；模型組心肌纖維出現(xiàn)斷裂，排列紊亂、邊界模糊，有明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)腫脹明顯；Dex 組與抑制劑組心肌纖維斷裂、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少、間質(zhì)腫脹均減輕。

2.2 各組血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH比較假手術(shù)組、模型組、Dex 組、抑制劑組血清CK-MB 分別為（17.95 ± 0.24）、（23.28 ± 0.32）、（20.32 ±0.28）、（19.18 ± 0.33）ng/mL，血清LDH 分別為（31.69 ± 0.27）、（40.11 ± 0.44）、（39.59 ± 0.55）、（38.50 ± 0.60）ng/L；血清CK-MB、LDH 模型組＞Dex組＞抑制劑組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。

2.3 各組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD 比較 假手術(shù)組、模型組、Dex 組、抑制劑組血清MDA 分別為（4.31 ± 0.09）、（5.17 ± 0.07）、（4.73 ± 0.13）、（4.52 ± 0.33）nmol/L，血清SOD 分別為（177.91 ±2.89）、（137.62 ± 2.90）、（156.91 ± 1.55）、（162.04 ±1.78）ng/L；血清MDA 模型組＞Dex 組＞抑制劑組＞假手術(shù)組，血清SOD假手術(shù)組＞抑制劑組＞Dex組＞模型組（P均＜0.05）。

2.4 各組心肌組織Epac1/Rap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 假手術(shù)組、模型組、Dex 組、抑制劑組心肌組織Epac1 蛋白表達(dá)分別為0.39 ± 0.07、0.89 ±0.06、0.72 ± 0.03、0.54 ± 0.10，心肌組織Rap1蛋白表達(dá)分別為0.05 ± 0.03、1.02 ± 0.01、0.83 ± 0.04、0.63 ± 0.05；心肌組織Epac1、Rap1蛋白表達(dá)模型組＞Dex組＞抑制劑組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。

3 討論

缺血性心臟病是因冠狀動(dòng)脈狹窄、供血不足而引起的心臟功能障礙及器質(zhì)性病變，在病理?xiàng)l件下，組織中常發(fā)生缺血再灌注損傷。缺血性損傷主要由厭氧性細(xì)胞死亡和再灌注引起，導(dǎo)致廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這些反應(yīng)能夠增加組織損傷，甚至損害整個(gè)機(jī)體。此外，缺血再灌注損傷還可以在心血管疾病的治療過(guò)程中加重原始疾病。因此，尋找預(yù)防和改善MIRI的方法并了解其相關(guān)機(jī)制，對(duì)減少患者并發(fā)癥發(fā)生率及病死率，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量具有重要意義。目前臨床中治療缺血性心臟病最有效的方式是恢復(fù)的心肌血液供應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)再灌注，常用的方法包括溶栓治療［7］、動(dòng)脈搭橋手術(shù)［8］、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)［9］等，但仍有許多患者在治療后因MIRI導(dǎo)致預(yù)后不良［10］。因此，有必要在恢復(fù)心肌血液供應(yīng)的同時(shí)探索能夠減輕缺血再灌注損傷的方法，以提高缺血性心臟病治療的有效性［11］。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠MIRI 模型并給予Dex 預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，與Dex 組比較，模型組的心肌組織出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷，同時(shí)血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH 的水平升高，提示Dex 腹腔注射預(yù)處理能夠減輕缺血再灌注引起的心肌組織損傷。

Dex 具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感神經(jīng)系統(tǒng)活性、心血管穩(wěn)定性、減少術(shù)后譫妄等作用，且沒(méi)有劑量依賴性，不會(huì)產(chǎn)生呼吸抑制，因此廣泛應(yīng)用于臨床麻醉［12］。ZHANG 等［13］研究顯示，Dex 能夠通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡等機(jī)制發(fā)揮器官保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 水平升高，SOD 水平降低。在給予Dex 預(yù)處理后，MDA 水平有所降低，SOD 水平升高，提示Dex 可降低心肌缺血再灌注的氧化應(yīng)激程度，從而減輕心肌損傷。臨床研究表明，Dex 的交感神經(jīng)溶解活性能夠通過(guò)降低代謝和預(yù)防心動(dòng)過(guò)速來(lái)降低心肌耗氧量，在心臟手術(shù)過(guò)程中可降低患者血流動(dòng)力學(xué)異常的風(fēng)險(xiǎn)［14］，同時(shí)使接受非心臟手術(shù)的心臟病患者受益，減少患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率［15］。此外，Dex 在腦、肺臟、肝臟及胃腸道等器官中也可起到保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。

Epac1/Rap1 是cAMP 信號(hào)通路中的關(guān)鍵途徑，Epac 存在Epac1、Epac2 兩種亞型，兩者的表達(dá)譜因其組織類型和發(fā)育階段不同而有所不同。例如，Epac1 主要在心臟、腎臟、血管、脂肪組織、中樞神經(jīng)組織和子宮中發(fā)現(xiàn)，而Epac2 在中樞神經(jīng)、胰腺和腎上腺中大量表達(dá)［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，Epac1/Rap1 通路與炎癥和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)有關(guān)，同時(shí)Epac1/Rap1信號(hào)通路在MIRI中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)［18］。當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，cAMP激活交換蛋白Epac1 及其下游的Rap1，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而加重心肌損傷［19］。基于此，本課題組提出一種假設(shè)，即Dex 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Epac1/Rap1 通路減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究在MIRI 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織中Epac1、Rap1 蛋白的表達(dá)升高；給予Dex 預(yù)處理的大鼠心肌組織中的Epac1、Rap1 蛋白表達(dá)較模型組減少；而給予Dex 聯(lián)合Epac1 特異性抑制劑ESI09 處理后，大鼠心肌組織中Epac1、Rap1蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少，心肌損傷減輕，氧化應(yīng)激反應(yīng)得到改善。這提示Dex 可能通過(guò)抑制Epac1/Rap1 信號(hào)通路的激活減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，這為Dex 抑制MIRI 提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

綜上所述，Dex 預(yù)處理對(duì)大鼠MIRI 具有抑制作用，其機(jī)制可能與激活Epac1/Rap1信號(hào)通路減輕心肌組織氧化應(yīng)激有關(guān)。然而我們的研究尚有一些局限性，我們沒(méi)有探索Epac1 在MIRI 過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定Dex 通過(guò)影響Epac1所發(fā)揮的治療潛力。