鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化研究

何平有，趙玉龍*，鄒立宏，郁宏偉，吳雅清，焦玉蘭，翟含流

[1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2.保定市蓮池區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北保定 071000]

從2010 年春季開(kāi)始，中國(guó)浙江、江蘇、山東、河北和北京等省市相繼暴發(fā)鴨坦布蘇病毒病（DTMU），該病以鴨產(chǎn)蛋下降為最主要特征，不同日齡的北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨、麻鴨和康貝爾鴨等均可發(fā)病，雛鴨發(fā)病后期出現(xiàn)精神沉郁、體重減輕、仰翻、側(cè)翻和死亡等臨床癥狀，若細(xì)菌繼發(fā)感染，出現(xiàn)肝周炎、心包炎和氣囊炎等，死淘率增加給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后表現(xiàn)為持續(xù)性產(chǎn)蛋率低下，由于繼發(fā)感染和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)纫蛩乜芍滤劳雎蔬_(dá)15%～20%。

疫苗免疫是預(yù)防該病流行、傳播的有效手段。2016 年以來(lái)我國(guó)通過(guò)新獸藥注冊(cè)的鴨坦布蘇病毒滅活疫苗和活疫苗各2 項(xiàng)（農(nóng)業(yè)部公告第2400 號(hào)、第2416 號(hào)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第73 號(hào)、第473 號(hào)頒布），2 類疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，滅活疫苗安全、有效，但需要多次免疫；活疫苗免疫產(chǎn)生期短，但有潛在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。筆者為了提高鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的免疫效果，進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 病毒液、試劑

2 批次鴨坦布蘇病毒HB 株（DTMUV-HB株）病毒液，病毒含量分別107.0ELD50/0.1mL 和107.3ELD50/0.1mL，由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)部提供。國(guó)產(chǎn)輕質(zhì)白油購(gòu)至杭州某公司，進(jìn)口白油和gel 佐劑購(gòu)自賽比克公司。鴨坦布蘇病毒HI 抗體檢測(cè)試劑由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

14 日齡健康櫻桃谷鴨（坦布蘇病毒抗原、抗體雙陰性）購(gòu)自河北某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 疫苗純化試驗(yàn)

將2 批次鴨坦布蘇病毒滅活病毒液先經(jīng)科百特深層過(guò)濾系統(tǒng)過(guò)濾，再經(jīng)300KD 中空纖維超濾濃縮10 倍，然后用PBS 還原，如此反復(fù)5 次；分別取純化前、純化中（深層過(guò)濾后）和純化后（中空纖維超濾后）病毒液樣品，測(cè)定樣品病毒含量（按照農(nóng)業(yè)部公告第2400 號(hào)方法）、總蛋白量（按現(xiàn)行獸藥典測(cè)定方法進(jìn)行）和SDS-PAGE分析，評(píng)價(jià)純化效果。

1.4 佐劑篩選

取上述純化方法制備的2 批次鴨坦布蘇滅活病毒抗原液，分別與3 種優(yōu)選佐劑配伍，制備滅活疫苗，6 組疫苗分別標(biāo)記為：A01、A02、B01、B02、C01、C02。

佐劑A 疫苗配制：將輕質(zhì)白油與司班80 按體積比94∶6 混合，126℃熬制1h 制成佐劑A；將上述滅活純化抗原加入4%吐溫80 制成水相；與佐劑A 按水油比1∶2 進(jìn)行乳化，12000r/min剪切5min，在無(wú)菌條件下分裝。

佐劑B 疫苗配制：將進(jìn)口白油與角鯊烯按體積 比99 ∶1 的比例混合，再加入6% 司班80，126℃熬制1h 制成佐劑B；將滅活純化抗原加入4%吐溫80 制成水相；然后與佐劑B 按水油比1∶2 進(jìn)行乳化，12000r/min 剪切5min，在無(wú)菌條件下分裝。

佐劑C 疫苗配制：將滅活純化抗原與佐劑C按體積比85∶15 混合，磁力攪拌30min，在無(wú)菌條件下分裝。

1.5 疫苗檢驗(yàn)

1.5.1 性狀檢驗(yàn)

取上述6 組疫苗進(jìn)行外觀、劑型、穩(wěn)定性、黏度等項(xiàng)目檢驗(yàn)。

1.5.2 安全性檢驗(yàn)

將上述6 組疫苗分別接種14 日齡健康易感櫻桃谷鴨，皮下注射，0.6mL/ 只，10 只/ 批，注射后觀察14d。

1.5.3 效力檢驗(yàn)

用14 日齡健康易感櫻桃谷鴨10 只/ 組，各胸部肌肉接種6 組佐劑疫苗，0.3mL/ 只。免疫后21d，連同不接種的對(duì)照鴨5 只，采血分離血清進(jìn)行鴨坦布蘇病毒HI 抗體測(cè)定，并各肌肉注射DTMUV-HB 株病毒液0.5mL/ 只。攻毒后2d 對(duì)所有鴨進(jìn)行采血，分離血清，接種雞胚進(jìn)行病毒分離，并對(duì)48～72h 死亡胚進(jìn)行PCR 鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗純化試驗(yàn)結(jié)果

2 批次鴨坦布蘇病毒滅活病毒液經(jīng)過(guò)深層過(guò)濾、中空纖維超濾二級(jí)純化，病毒含量下降不超過(guò)0.2 個(gè)滴度，而總蛋白下降到0.50mg/mL 以下，2 批次病毒液除雜率均高于80%，有效去除雜蛋白。詳見(jiàn)表1 和圖1。

表1 坦布蘇病毒液純化前后病毒含量和蛋白含量變化

圖1 坦布蘇病毒液純化樣品SDS-PAGE 情況

2.2 性狀檢驗(yàn)結(jié)果

3 種佐劑制備的6 組疫苗性狀檢驗(yàn)，外觀、劑型和穩(wěn)定性等均合格，佐劑A 和佐劑B 制備的疫苗為油佐劑疫苗，粘度適中為50～60cP；而佐劑C制備的疫苗為水性佐劑疫苗，粘度最低（表2）。

表2 不同佐劑鴨坦布蘇滅活疫苗物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 安全性檢驗(yàn)結(jié)果

3 種佐劑制備的6 組疫苗，免疫14 日齡櫻桃谷鴨，觀察14d 內(nèi)免疫鴨均10/10 健活，精神、采食和糞便無(wú)異常，安全檢驗(yàn)均合格（表3）。

表3 不同佐劑鴨坦布蘇病毒滅活疫苗安全檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 效力檢驗(yàn)結(jié)果

3 種佐劑制備的6 組疫苗，免疫14 日齡櫻桃谷鴨，免疫21d 后測(cè)定鴨坦布蘇病毒HI 抗體，并進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)；佐劑B 組抗體水平和攻毒保護(hù)率最高，佐劑A 組次之，佐劑C 組最差。詳見(jiàn)表4、表5 和圖2。

表4 不同批次疫苗鴨坦布蘇HI 抗體檢驗(yàn)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同批次疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

圖2 不同批次疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果（死亡胚）

3 討論

近幾年隨著科技發(fā)展，鴨坦布蘇病毒培養(yǎng)工藝由原來(lái)禽胚和貼壁細(xì)胞培養(yǎng)演變?yōu)槿珣腋∨囵B(yǎng)[2]，顯著提升生產(chǎn)效率。全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度大，破碎后的雜蛋白也多，部分雜蛋白在免疫反應(yīng)中被免疫細(xì)胞識(shí)別，影響疫苗免疫效果，且增加免疫副反應(yīng)發(fā)生幾率。筆者通過(guò)深層過(guò)濾和超濾的方法處理抗原，處理后抗原的病毒含量下降（抗原損失）不超過(guò)0.2 個(gè)滴度，抗原總蛋白由原來(lái)2.1～2.3mg/mL 下降到0.36～0.38mg/mL（常規(guī)的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)工藝病毒液總蛋白一般在1.2mg/mL左右），有效去除80%以上雜蛋白，顯著提升抗原純度，符合“新概念疫苗”理論[3]要求，制備的疫苗安全性好、不浪費(fèi)動(dòng)物機(jī)體的免疫力。

免疫佐劑是指一類能非特異性地增強(qiáng)或改變機(jī)體對(duì)匹配抗原的特異性免疫應(yīng)答，可以增強(qiáng)抗原的免疫原性或者改變免疫的反應(yīng)類型，但其本身并無(wú)抗原性的一類物質(zhì)[4,5]。本研究采用2 種油佐劑（佐劑A 和佐劑B）和1 種水性佐劑（佐劑C）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示油佐劑效果更好，最優(yōu)的佐劑B 疫苗效力檢驗(yàn)HI 抗體水平高達(dá)1∶320和攻毒保護(hù)率高達(dá)10/10，進(jìn)口佐劑B 為鴨坦布蘇病毒滅活疫苗優(yōu)選佐劑，安全性和免疫效果均表現(xiàn)良好。

4 結(jié)論

筆者認(rèn)為，油佐劑包裹鴨坦布蘇病毒抗原，使抗原免受動(dòng)物機(jī)體酶解與消除，純化抗原緩慢釋放，被機(jī)體更準(zhǔn)確識(shí)別與提呈，使其產(chǎn)生高效免疫應(yīng)答；另外，佐劑B 是一種礦物油，與角鯊烯配合能更好刺激機(jī)體局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而輔助提高機(jī)體的整體免疫應(yīng)答水平。2020 年任肖[6]采用免疫佐劑取得類似的效果，這從另一方面佐證了該技術(shù)應(yīng)用效果。本研究為鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的開(kāi)發(fā)提供有益參考。