‘茶花’藍(lán)莓莖段初代培養(yǎng)體系建立

朱秀蕾，張 林，余碧霞

（安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林與服裝學(xué)院，安慶 246003）

藍(lán)莓（Vacciniumspp.）屬杜鵑花科越桔屬多年生灌木，又稱藍(lán)漿果或越桔，落葉或常綠果樹，果實(shí)為小漿果類，果皮較薄，果肉酸甜，原產(chǎn)地和主要產(chǎn)區(qū)均在北美洲地區(qū)[1]。由于藍(lán)莓果實(shí)具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，可以改善人類亞健康狀況，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[2]。‘茶花’藍(lán)莓又稱為卡米爾藍(lán)莓，美國佐治亞大學(xué)2005年推出的中早熟南高叢藍(lán)莓品種，植株高且枝條生長旺盛，直立，樹冠開張但冠幅較窄，果粒大，果實(shí)亮藍(lán)色，果蒂痕小而干，果實(shí)硬度好且風(fēng)味佳，適合鮮食市場。傳統(tǒng)的扦插繁殖和種子繁殖耗時(shí)長、效率低，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可快繁藍(lán)莓種苗[3]。目前‘茶花’藍(lán)莓品種初代培養(yǎng)的研究鮮有報(bào)道，所以本研究以‘茶花’藍(lán)莓為試材，探討滅菌劑、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基等因素對‘茶花’藍(lán)莓初代培養(yǎng)的影響，從而為‘茶花’藍(lán)莓組培快繁體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：‘茶花’藍(lán)莓當(dāng)年新抽出的半木質(zhì)化莖段，采自安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝基地。

供試試劑：玉米素（zeatin，ZT），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA），上海宇航生物科技有限公司；吲哚-3乙酸（3-indoleacetic acid，IAA），廣州市林國化肥有限公司。

供試培養(yǎng)基：改良WPM培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖[4]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇與處理 將采集的‘茶花’藍(lán)莓帶腋芽莖段放入有少量洗衣粉的清水中清洗，然后用解剖刀切割成2～3 cm段，先在流水下不斷沖洗30 min，再用無菌水沖洗，瀝干水后，將試材放到超凈工作臺[5]。

1.2.2 外植體滅菌劑處理 將75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液2種滅菌劑設(shè)為2個(gè)因素，按不同的滅菌時(shí)間設(shè)置3個(gè)水平，A1、A2、A3分別為75%乙醇漂洗10、20、30 s；N1、N2、N3分別為2.5%次氯酸鈉溶液消毒5、10、15 min；交叉組合共9個(gè)處理（A1N1、A1N2、A1N3、A2N1、A2N2、A2N3、A3N1、A3N2、A3N3），重復(fù)3次。

1.2.3 外植體接種 將莖段與滅菌劑接觸的兩頭剪掉，莖段截成0.5～0.7 cm作為外植體接種于培養(yǎng)基中，改良WPM+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g /L，pH 5.8，重復(fù)3次，每處理接種5瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10個(gè)外植體，置于溫度為（28±2）℃、光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx、光照時(shí)間為12 h/d下培養(yǎng)，10 d后統(tǒng)計(jì)‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體成活率。外植體成活率（%）=外植體成活總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 將滅菌的‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體分別接種到改良WPM，附加不同質(zhì)量濃度配比的6-BA、ZT誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。6-BA質(zhì)量濃度設(shè)置4個(gè)水平，B1、B2、B3、B4的6-BA質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L；ZT質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)水平，Z1、Z2、Z3的ZT質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；交叉組合共12個(gè)處理（B1Z1、B1Z2、B1Z3、B2Z1、B2Z2、B2Z3、B3Z1、B3Z2、B3Z3、B4Z1、B4Z2、B4Z3），重復(fù)3次，每處理接種5瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10個(gè)外植體，置于溫度為（28±2）℃、光照強(qiáng)度為 1 500～2 000 lx、光照時(shí)間為12 h/d下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)‘茶花’藍(lán)莓叢生芽誘導(dǎo)率。叢生芽誘導(dǎo)率（%）=不定芽誘導(dǎo)總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.2.5 增殖培養(yǎng)基篩選 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基生成的叢生芽分別接種到改良WPM，附加不同質(zhì)量濃度配比的IAA、ZT增殖培養(yǎng)基中。IAA質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)水平，I1、I2、I3的IAA質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；ZT質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)水平，Z1、Z2、Z3的ZT質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L；交叉組合共9個(gè)處理（I1Z1、I1Z2、I1Z3、I2Z1、I2Z2、I2Z3、I3Z1、I3Z2、I3Z3），重復(fù)3次，每處理接種5瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10個(gè)叢生芽，置于溫度為（28±2）℃、光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx、光照時(shí)間為12 h/d下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率。叢生芽增殖率（%）=叢生芽分化總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 2006軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Turkey檢驗(yàn)法進(jìn)行組間顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體成活率的影響

由表1可知，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體在A3N2處理中成活率與其他處理比較差異顯著，在A2N2和A3N3處理、A1N3和A2N1處理中成活率差異不顯著。如果滅菌時(shí)間較短，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體接種后第3天出現(xiàn)污染，A1N1處理污染嚴(yán)重。隨著消毒時(shí)間延長，污染率逐漸下降。如果75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液滅菌時(shí)間過度，外植體成活率降低。綜上，A3N2處理滅菌效果最好，外植體成活率最高，為96.21%，所以‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體表面滅菌除了選擇合適的滅菌劑種類外，選擇合適的滅菌時(shí)間也很重要。

表1 不同滅菌劑對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體成活率的影響

2.2 不同6-BA、ZT處理對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)率的影響

由表2可知，‘茶花’藍(lán)莓莖段在B3Z2處理中叢生芽誘導(dǎo)率與其他處理比較差異顯著，在B2Z3、B3Z1、B3Z3、B4Z2處理中對叢生芽誘導(dǎo)率的影響差異不顯著。‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽誘導(dǎo)主要受培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素調(diào)控，6-BA對‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽誘導(dǎo)率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽誘導(dǎo)率最高。綜上，在B3Z2處理中誘導(dǎo)效果最好，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)率最高，為97.91%。

表2 6-BA、ZT配比對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同IAA、ZT處理對‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率的影響

由表3可知，‘茶花’藍(lán)莓在I2Z2處理中叢生芽增殖率與其他處理比較差異顯著，在I1Z2和I2Z1處理中對叢生芽增殖率差異不顯著。‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽增殖主要受培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素調(diào)控，IAA對‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽增殖率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓莖段叢生芽增殖率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率最高。綜上，在I2Z2處理中增殖效果最好，‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率最高，為93.01%

表3 IAA、ZT配比對‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率的影響

3 討 論

3.1 不同滅菌劑處理對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體成活率的影響

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)無菌培養(yǎng)體系構(gòu)建的第一步。外植體從室外采集時(shí)上面附著大量的細(xì)菌和病毒，滅菌劑的種類、濃度、滅菌時(shí)間直接影響外植體的滅菌效果，金如意等[6]研究表明，5%NaClO溶液消毒10 min，再用0.1% HgCl2溶液消毒7 min外植體的消毒效果最好。但是因HgCl2溶液有劇毒，在實(shí)際生產(chǎn)中存在著巨大的安全隱患，所以筆者通過試驗(yàn)尋求既安全又高效的滅菌方法，在‘茶花’藍(lán)莓的組織培養(yǎng)過程中，研究不同滅菌劑對‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體成活率的影響。本研究表明，如果滅菌時(shí)間較短，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體接種后第3天出現(xiàn)污染。隨著消毒時(shí)間延長，污染率逐漸下降，而75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液滅菌時(shí)間過度，外植體的成活率降低。

3.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對‘茶花’藍(lán)莓初代培養(yǎng)的影響

植物生長激素中的細(xì)胞分裂素對藍(lán)莓叢生芽的誘導(dǎo)和增殖起到了至關(guān)重要的作用，且藍(lán)莓品種不同所適用的細(xì)胞分裂素種類和用量也不同。廉家盛等[7]研究表明，ZT對藍(lán)莓叢生芽的誘導(dǎo)和增殖具有顯著效果，且不同的藍(lán)莓品種用量也有差別。本研究表明，在‘茶花’藍(lán)莓初代培養(yǎng)過程中，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)率最高。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率最高。而6-BA對‘茶花’藍(lán)莓叢生芽誘導(dǎo)率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT，與李森等[8]研究結(jié)論一致。IAA對‘茶花’藍(lán)莓叢生芽增殖率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。本研究對‘茶花’藍(lán)莓初代培養(yǎng)進(jìn)行了探討，為‘茶花’藍(lán)莓品種的工廠化育苗和商品基地的建設(shè)奠定了基礎(chǔ)，對‘茶花’藍(lán)莓的生根培養(yǎng)、馴化移栽還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究表明‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體在初代培養(yǎng)過程中，‘茶花’藍(lán)莓莖段外植體用75%乙醇浸泡30 s，再用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，滅菌效果最好，成活率最高。改良WPM+6-BA 1.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基最適宜莖段腋芽誘導(dǎo)；改良WPM+IAA 1.0 mg/L+ZT 1.5mg /L增殖培養(yǎng)基最適宜再生芽增殖。在植物組培初代培養(yǎng)過程中，影響制約外植體成苗的因素很多，本研究僅對‘茶花’藍(lán)莓滅菌劑種類、激素質(zhì)量濃度和種類進(jìn)行了初探，其他不同激素配比、光照條件等因素仍需要進(jìn)一步研究。