一測多評法同時測定菊花配方顆粒中8個成分的含量

趙劍鋒，宋宗華*，劉靜

1.國家藥典委員會，北京 100061；

2.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

2021 年4 月，國家藥品監督管理局頒布首批160 個中藥配方顆粒國家標準[1]，其中包括菊花配方顆粒國家標準。菊花配方顆粒為菊花經炮制并按標準湯劑的主要質量指標加工制成的配方顆粒。菊花為菊科菊屬多年生草本植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功能，臨床上用于治療風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[2]。現代研究表明，菊花中主要有黃酮類、揮發油、苯丙素類、萜類、氨基酸等化學成分，其中黃酮和苯丙素類化合物為菊花的主要藥效成分[3]。目前，菊花及其配方顆粒國家標準均以木犀草苷、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸作為質量控制指標。除了上述3 個成分，其他黃酮類和苯丙素類成分也是菊花配方顆粒發揮作用的重要物質基礎。近年來，一測多評法（QAMS）在中藥整體質量控制領域被廣泛應用，在中藥同類化學成分含量測定方面日漸成熟[4-10]。本研究采用QAMS，以木犀草苷為內標物，通過建立其與綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的相對校正因子（RCF），同時計算出其他待測成分的含量，實現多個成分的同步含量測定，用于菊花配方顆粒的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-30AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；H-Class 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ-300DA 型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型純水儀（美國Millipore 公司）；AE-240 型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號：110753-202119，純度：96.3%）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號：111782-201807，純度：94.3%）、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號：111894-202104，純度：95.1%）、木犀草苷（批號：111720-201807，純度：96.6%）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號：111968-201602，純度：97.7%）、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號：111717-201402，純度：94.5%）、蘆丁（批號：100080-202012，純度：91.6%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Y-069-170516，純度＞98.0%）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為純化水。

7批菊花配方顆粒樣品信息見表1。

表1 7批菊花配方顆粒樣品信息

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品適量，加70%甲醇制成質量濃度分別為1.070、1.114、1.080、1.088、1.019、0.378、1.177、1.310 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液適量至20 mL量瓶中，加70%甲醇制成質量濃度分別為53.50、55.70、54.00、54.40、50.95、37.80、58.85、65.50 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（300 W，40 kHz）40 min，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～10 min，10%～20%A；10～36 min，20%A；36～40 min，20%～90%A）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL；檢測波長：348 nm。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品及菊花配方顆粒樣品高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 分別精密吸取系列質量濃度的混合對照品溶液，按照2.2 項下色譜條件進行測定。分別以各對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程，結果見表2。結果表明8個成分在一定質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

表2 菊花配方顆粒中8個成分的線性關系

2.3.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μL，按2.2 項下色譜條件測定，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD 分別為0.30%、0.80%、0.19%、0.18%、0.15%、0.12%、0.32%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取按2.1.2 項下方法制備的供試品（JHPF-1）溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按2.2 項下色譜條件測定各成分的峰面積，結果綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD 分別為1.17%、1.24%、0.96%、1.12%、0.98%、1.32%、1.08%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品（JHPF-1）6份，每份約0.2 g，研細，精密稱定，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜條件測定各成分的峰面積，計算含量。結果樣品中綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸平均質量分數分別為0.457%、0.143%、0.461%、0.918%、0.332%、0.492%、0.721%、0.712%，含量的RSD分別為1.85%、1.43%、2.18%、1.25%、2.28%、1.05%、2.09%、1.49%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的菊花配方顆粒（JHPF-1）6 份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.1.1 項下單一對照品綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸儲備液適量，按2.1.2 項下方法制備供試溶液，按2.2 項下色譜條件測定，記錄峰面積，分別計算回收率。8 個成分平均加樣回收率分別為98.4%、97.1%、96.7%、99.4%、102.1%、97.2%、98.2%、98.2%，回收率的RSD分別為2.9%、2.9%、2.7%、1.9%、1.8%、2.6%、1.8%、2.4%。

2.4 RCF計算

精密吸取2.1.1 項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按2.2 項色譜條件進樣測定，以木犀草苷為內標物，按公式（1）計算其他7 個成分的相對校正因子（f）。

式中Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分質量濃度；As為內標物峰面積，Cs為內標物質量濃度，結果見表3。

表3 菊花配方顆粒7個待測成分RCF

2.5 RCF耐用性考察

2.5.1 高效液相色譜儀和色譜柱 在Waters HClass、LC-30AD 2 種高效液相色譜儀考察了Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 根不同色譜柱對RCF 的影響，各成分在不同色譜儀和不同色譜柱上的RCF 的RSD 均小于5%，表明不同色譜儀和不同色譜柱所得的RCF 差異無統計學意義，見表4。

表4 不同儀器和色譜柱對菊花配方顆粒7個待測成分RCF的影響

2.5.2 柱溫 采用島津LC_30AD 高效液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。考察不同柱溫（25、30、35 ℃）對RCF 影響，結果顯示，RCF差異無統計學意義，RSD＜5%，見表5。

表5 不同柱溫對菊花配方顆粒7個待測成分RCF的影響

2.5.3 流動相流速 考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）對RCF 的影響，精密吸取混合對照品溶液2 μL 注入液相色譜儀中，記錄峰面積。各成分RCF 的RSD 均小于5%，表明不同流速對各成分RCF影響差異無統計學意義，見表6。

表6 不同流動相流速對菊花配方顆粒7個待測成分RCF的影響

2.6 色譜峰定位

采用相對保留時間法，以木犀草苷為基準峰，在不同色譜柱下對該參數進行考察。結果表明，不同色譜柱下各成分間的相對保留值波動較小，RSD均小于5%，見表7。

表7 不同色譜柱下菊花配方顆粒7個待測成分的相對保留時間

2.7 QAMS與外標法（ESM）的結果比較

分別取7批樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下色譜條件進行測定，采用ESM和QAMS計算菊花配方顆粒中綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量，見表8。2種方法所得到的8個成分含量基本一致，RSD＜5%，QAMS可以代替ESM進行多成分質量評價。

表8 ESM和QAMS測定菊花配方顆粒8個成分質量分數（n=3）mg·g-1

3 討論

本研究參考了菊花配方顆粒國家標準含量測定方法，采用70%甲醇對樣品進行超聲處理，檢測波長選擇為348 nm，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液。參考已報道的菊花藥材多成分含量測定方法[11-13]，選擇Agilent TC-C18色譜柱，在此基礎上對梯度洗脫條件進行優化，結果表明本方法的8 個成分得到基線分離。

QAMS 可以通過單個成分實現多個成分的同步測定，木犀草苷對照品保留時間處于中間位置，比較容易獲取，并且在配方顆粒中的含量相對穩定，因此選擇其作為參照物。通過測定，其他7 個成分的相對保留時間和RCF 重復性良好。采用ESM 和QAMS對7批菊花配方顆粒中8個成分的含量測定結果進行比較分析，采用RSD 比較2種方法的準確性。2 種方法對同一樣品的測定結果之間的RSD 均在3%以內，表明2 種測定方法所得結果具有較好的重復性。

通過比較4家企業生產的7批菊花配方顆粒中8個成分的含量，發現綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸3 個成分含量均在法定標準限度內，并且重復性較好。但是不同企業生產的配方顆粒中1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量差異較為明顯，可能為生產原料和工藝所致。

4 結論

本研究所建立的QAMS 同時測定了菊花配方顆粒中8 個成分的含量的方法準確、穩定、重復性好，在降低分析檢測成本的同時，可以更全面地反映菊花配方顆粒內在質量，對于完善菊花配方顆粒國家標準具有一定參考價值。