指紋圖譜結合一測多評在中成藥丹參片質量控制中的應用

周亞楠，胡曉茹，戴忠，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

丹參片是以丹參為原料提取制得的片劑，收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部），主要用于治療冠心病、心絞痛等疾病[1]。丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩等功效。研究表明，丹參主要含水溶性和脂溶性兩類成分，這兩類成分具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗凝血等藥理作用，均為丹參的主要活性成分[2-5]。其中，水溶性成分主要為酚酸類成分，如丹酚酸B、丹參素等；脂溶性成分大多為共軛醌、酮類成分，如丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ等。

中藥成分復雜，單一成分難以評價中藥整體質量，中藥指紋圖譜及多指標成分定量的方法是現在常用的中藥質量控制模式[6-7]。中藥指紋圖譜體現中藥的整體性，提供中藥中多成分整體信息，多用于中藥的整體質量評價。多指標成分含量測定是中藥質量評價的另一種方式，常規的含量測定方法常出現對照品難以獲得的不足，一測多評法（QAMS）是以樣品中某一組分（對照品易獲得且穩定）為參照物，通過相對校正因子計算其他組分的含量，其可以彌補多組分同時測定時對照品難以獲得、制備成本高、不穩定等不足。因此，指紋圖譜與QAMS相結合可以全方位評價中藥質量，已經成為中藥質量控制的趨勢[8-15]。

《中國藥典》2020 年版（一部）以水溶性成分丹酚酸B 控制丹參片的質量，并未收載脂溶性成分的測定方法[16]，質量控制指標不完整，難以全面準確反映丹參片的質量。本研究采用QAMS，以丹參酮ⅡA為參照物同時測定丹參片中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，并結合指紋圖譜全面、科學地評價丹參片的質量，為丹參片的質量控制提供良好的技術手段，同時為丹參片的質量標準研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；1260型高效液相色譜儀（Agilent公司）；KQ-300DA 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XPE105型十萬分之一電子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品丹參酮ⅡA（批號：110766-201721，純度：99.5%）、隱丹參酮（批號：110852-201807，純度：99.0%）、丹參酮Ⅰ（批號：110867-201607，純度：98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸為分析純。

丹參片編號為S1～S3（A 廠家，批號分別為170934、170935、170936）；丹參片編號為S4～S6（B 廠家，批號分別為180101、180401、180402）；丹參片編號為S7～S12（C 廠家，批號分別為180405、180406、180407、180408、180501、180502）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

混合對照品溶液的制備：分別取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對照品約10、15、10 mg，精密稱定，分別置于50、50、100 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲使溶解（300 W，50 kHz），并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對照品儲備液各5 mL，置于同一50 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取丹參片20 片，除去糖衣，研細，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～6.0 min，61%A；6.0～20.0 min，61%～90%A；20.0～20.5 min，90%～61%A；20.5～25.0 min，61%A）；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S7）按2.2 項下色譜條件連續進樣6 次，以丹參酮ⅡA為參照峰，測定各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3.0%，儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批丹參片（S7）按2.1項下方法平行制備6 份供試品溶液，以丹參酮ⅡA為參照峰，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S7）分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h連續進樣測定，以丹參酮ⅡA為參照峰，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.3.4 指紋圖譜的建立、共有峰指認及相似度評價 按2.2 項下色譜條件對12 批丹參片供試品溶液進行測定，比較各批供試品的色譜圖，共標定5 個共有峰。以乙腈-0.02%甲酸為流動相，采用超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）正離子模式掃描對未知峰進行確認，峰1的母離子m/z為279.103 8，碎片離子m/z為261、251、233、205、169，最大吸收波長為242、290 nm，峰2的母離子m/z為338.974 5，碎片離子m/z為279、261、233，最大吸收波長為224、272 nm，經文獻對比確認峰1、峰2分別為二氫丹參酮Ⅰ、丹參酸甲酯[17-20]。峰3 的母離子為297.128 7，最大吸收波長為219、263 nm，峰4 的母離子m/z為277.150 0，最大紫外吸收為244 nm，峰5 的母離子m/z為295.111 9，最大吸收波長為224、269 nm，經對照品比對、質譜及紫外確認，峰3、峰4、峰5 分別為隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）對12 批丹參片的指紋圖譜進行相似度評價，以S1 為參照譜圖，選定5 個特征峰進行多點校正，全譜峰匹配。匹配后的12 批樣品圖譜見圖1，平均數法生成對照圖譜（圖2）。12 批丹參片的相似度分別為0.997、0.996、0.996、0.998、0.997、0.996、1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，結果顯示12 批樣品的圖譜與對照指紋圖譜相似度較高，表明12 批丹參片的脂溶性化學成分一致性較好。

圖1 各批次丹參片的疊加色譜圖

圖2 丹參片對照指紋圖譜

2.4 QAMS研究

隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA是丹參片中主要脂溶性成分，也是主要活性成分。本研究采用QAMS，以丹參酮ⅡA為對照同時測定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量，提高丹參片的質量控制水平。

2.4.1 專屬性 取供試品溶液、混合對照品溶液及空白溶劑，按2.2 項下色譜條件分析，結果見圖3。隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA分離良好，空白溶劑在3 個成分保留時間處無色譜峰干擾，供試品中出現與對照品溶液中一致的色譜峰，表明本法專屬性良好。

圖3 空白溶劑、對照品及丹參片供試品色譜圖

2.4.2 線性關系考察 逐級稀釋對照品儲備液1～100 倍，得到7 個不同質量濃度的對照品溶液，按2.2 項下色譜條件分析，以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 丹參片中3個成分的線性關系結果

2.4.3 精密度試驗 取同一供試品溶液（S7）連續進樣6 次，結果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.17%、0.20%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批丹參片（S7）平行制備6份供試品溶液，進行HPLC分析，計算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量。結果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ含量的RSD 分別為1.64%、1.25%、2.46%，表明方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S7）及混合對照溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 連續進樣測定，供試品溶液中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.53%、0.87%、0.61%，對照品溶液中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.39%、0.44%、0.53%，表明對照品及供試品溶液在48 h內穩定。

2.4.6 回收率試驗 取丹參片（S7）粉末9 份，各約0.4 g，精密稱定，平均分為3 組，每組分別精密加入丹參酮ⅡA對照品儲備液1、2、3 mL，隱丹參酮對照品儲備液1、2、3 mL，丹參酮Ⅰ對照品儲備液1、3、5 mL，按2.1項下方法制備，進樣分析后，計算平均加樣回收率，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的平均回收率分別為101.27%、99.56%、101.49%，RSD 分別為0.80%、0.76%、1.22%，表明方法準確性良好。

2.4.7 相對校正因子的計算 常用的相對校正因子計算方法有多點校正法、斜率校正法和定量因子校正法[21]。取2.4.2項下溶液，按2.2項下色譜條件測定，采用斜率校正法計算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ相對丹參酮ⅡA的校正因子分別為1.16、1.37。儀器、色譜柱、流速等的微小改變會影響相對校正因子的大小。因此，分別選擇了2 個品牌儀器（Waters E2695 型、Agilent 1260 型）、3 根色譜柱（CAPCELL PAK C18MG Ⅱ、Kromasil 100-5-C18、COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ，規格均為250 mm×4.6 mm，5 μm），同時改變流速，考察其對待測成分相對校正因子測定的影響，結果見表2。

表2 不同儀器、不同色譜柱和不同流速條件下丹參片中主要成分的相對校正因子

2.4.8 待測成分色譜峰定位 本研究將待測成分光譜信息與相對保留值相結合對各成分色譜峰進行準確定位。隱丹參酮的最大吸收波長為219、263 nm，丹參酮Ⅰ的最大吸收波長為244 nm，改變儀器、色譜柱、流速后，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對保留時間見表3，各待測成分相對保留時間的RSD均小于3%。

表3 不同儀器、不同色譜柱和不同流速條件下丹參片中主要成分的相對保留時間

2.4.9 樣品測定 按2.1、2.2項下方法分析不同批次的丹參片，采用對照品外標法和QAMS 計算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量及其總含量（表4），對照品外標法和QAMS 對丹參片定量測定結果基本一致。

表4 丹參片中各成分的QAMS與外標法測定結果mg/片

3 討論

本研究采用中藥指紋圖譜獲得丹參片脂溶性成分的整體信息，采用QAMS以丹參酮ⅡA為參照物測定丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，中藥指紋圖譜結合QAMS 可以很好地實現整體評價制劑的質量。

QAMS 常用的指標成分色譜峰定位方法有相對保留值和保留時間差[21-22]，《中國藥典》 2020年版丹參藥材項下以丹參酮ⅡA為參照，采用相對保留值法確定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的色譜峰，從而測定丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量。但實驗發現隱丹參酮與丹參酮Ⅰ在不同色譜柱上的目標峰的相對位置有時會互換，如ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱上丹參酮Ⅰ先于隱丹參酮出峰，CAPCELL PAK C18MG Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱上隱丹參酮先于丹參酮Ⅰ出峰。因此，僅根據相對保留值和保留時間差對指標成分色譜峰定位有時會出現問題。增加供試品的典型色譜圖，規定相對保留時間，同時，利用丹參酮Ⅰ、隱丹參酮2 種成分最大紫外吸收波長不同（丹參酮Ⅰ：244 nm，隱丹參酮：219、263 nm）可確定各成分的色譜峰位置，實現對目標峰定位，有效果補充了QAMS 中指標成分色譜峰定位的不足。

丹參酮ⅡA具有光不穩定性及熱不穩定性[23-24]，本研究采用超聲提取法作為丹參片中脂溶性成分的提取方法，高效、快速，避免了光照、高溫使丹參酮ⅡA轉化分解造成的誤差。同時，考察了提取溶劑（水、25%、50%、75%甲醇、純甲醇）、提取時間（10、20、30、40 min）等主要因素的影響，最終確定樣品提取條件為50 mL甲醇超聲處理20 min。

本研究提出并建立了指紋圖譜結合QAMS 全面評價丹參片中脂溶性化學成分的方法，具有靈敏度強、準確度高、重復性好、穩定性好的特點，可為丹參片的質量控制提供參考。