中藥配方顆粒難溶性物質與高分子化合物的紅外光譜分析△

劉芬，楊樂，董玲，陳建波

北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經水加熱提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒[1]。服用方便、調配靈活等優勢賦予中藥配方顆粒廣闊的發展前景[2]，而可靠的質量保證是必備前提。因為失去了中藥飲片的性狀和顯微特征，化學成分檢測是中藥配方顆粒質量評價的關鍵手段[3]。中藥配方顆粒制備時需以水為溶媒加熱提取[1]，但是現有質量標準主要使用色譜方法檢測其中可溶于有機溶劑的小分子化合物[4-6]，缺少針對其他類型成分的化學表征，不能全面整體地評價中藥配方顆粒的物質組成。

中藥配方顆粒制備時可以使用必要的輔料[1]。輔料種類和用量可能影響服藥劑量、藥物溶出和吸收等[3,7]，是中藥配方顆粒質量評價時應考慮的因素。中藥顆粒劑常用輔料多為高分子和無機物，難以直接體現在基于液相色譜或氣相色譜的指紋圖譜或特征圖譜中。中藥飲片水提物可能含有多糖、蛋白質等高分子化合物，有些情況下這些成分是重要藥效物質。因此，高分子化合物檢測對于中藥配方顆粒質量評價是很有必要的。中藥配方顆粒沖服時可能存在難溶性物質[3]。這些難溶性物質可能是沒有除凈的飲片殘渣，或者是人為添加的難溶性輔料，還可能是因為后續生產過程降低了某些成分的溶解性。因此，難溶性物質檢測對于中藥配方顆粒質量評價很有必要。

波數為4000～400 cm-1的中紅外光譜（《中華人民共和國藥典》稱為“紅外分光光度法”，以下簡稱紅外光譜）是固體樣品、高分子樣品的經典分析方法之一，可用于中藥配方顆粒的難溶性物質與高分子化合物檢測。紅外光譜可以直接檢測固體、液體、氣體等各種形態物質，能夠同時獲得有機小分子、有機大分子、無機成分等各類成分信號，從而快速且整體地表征中藥配方顆粒的物質組成[8-12]。但是，樣品未經分離而直接進行紅外光譜檢測時，不同成分的光譜信號相互疊加，降低了靈敏度和專屬性。因此，本研究嘗試先對樣品進行溶劑分離，然后用紅外光譜檢測不同溶劑分離部位，獲得中藥配方顆粒所含難溶性物質和高分子化合物的化學組成信息。

1 材料

1.1 樣品

中藥配方顆粒樣品由生產廠家A、B、C、D 提供（表1）。茯苓飲片（批號：20200409，北京上醫仁家中醫診所有限公司）經北京中醫藥大學王晶娟教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。

表1 中藥配方顆粒樣品信息

1.2 試藥

硬脂酸鈣（批號：C12785783，鈣質量分數6.6%～7.4%）、干法云母粉（批號：C13718326，1250 目）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；硅膠（批號：C2204266，分析純，300～400 目）、聚氧化乙烯（PEO，批號：C2211203，黏度平均分子質量約100 萬）、草酸鈣水合物（批號：J1816073，純度98%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糊精[葡萄糖當量（DE）≤18]購自山東西王糖業有限公司。

1.3 儀器

VERTEX 70 型傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker 公司），配有Platinum ATR 衰減全反射附件；Milli-Q? Integral 5型純水系統（德國Merck Millipore公司）；BT25S 型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KH7200DB 型數控超聲波清洗器（江蘇昆山禾創超聲儀器有限公司）；3-18N 型臺式高速離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）。

2 方法

2.1 中藥配方顆粒溶劑分離

如圖1 所示，使用溶劑分離法獲得各配方顆粒樣品的難溶部位、三氯甲烷部位、乙醇部位、水溶部位，揮干或凍干除去溶劑后進行紅外光譜測試。

2.2 紅外光譜測試與數據處理

適量水或乙醇清潔ATR 附件的內反射晶體表面，溶劑揮干后測量背景光譜；然后取樣品適量，置于內反射晶體表面，用ATR 附件自帶壓桿保證樣品與內反射晶體表面緊密接觸，測量樣品光譜。背景光譜與樣品光譜測量范圍4000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，單張光譜累積掃描32 次。以透過率（T）為縱坐標記錄樣品光譜測量結果，然后進行如下處理：1）使用光譜儀配套軟件的插值功能將所有光譜橫坐標間隔調整為1 cm-1；2）光譜縱坐標由T轉為吸光度[A，A=lg(1/T)]；3）對光譜進行ATR 校正；4）對光譜進行自動基線校正；5）光譜縱坐標歸一化，使2000～800 cm-1區域內最高吸光度為1、最低吸光度為0。

3 結果與討論

3.1 中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜分析

當歸-A、黨參-A、黨參-C、黃芪-C 4個配方顆粒樣品的難溶部位與硅膠（SiO2·xH2O）的紅外光譜見圖2。硅膠的紅外光譜中1068、456 cm-1分別為Si-O 伸縮振動和彎曲振動吸收峰，3385、1628 cm-1分別為O-H 伸縮振動和彎曲振動吸收峰。結合水的影響使硅膠Si-O 吸收峰與無水二氧化硅有明顯差異。廠家A 當歸和黨參配方顆粒、廠家C 黨參和黃芩配方顆粒的難溶部位紅外光譜與硅膠一致，說明這些配方顆粒中可能添加了微粉硅膠作為輔料。

圖2 含有硅膠的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

幾種配方顆粒的難溶部位與草酸鈣水合物（CaC2O4·xH2O）的紅外光譜見圖3。草酸鈣水合物的紅外光譜中1613、1315 cm-1分別為羧酸根離子C-O反對稱和對稱伸縮振動吸收峰，3500～3000 cm-1區域為結晶水O-H 伸縮振動吸收峰。廠家B 黨參配方顆粒、廠家D 當歸和金銀花配方顆粒的難溶部位紅外光譜中1640、1320 cm-1附近吸收峰與草酸鈣水合物相似，但并非完全一致。這可能是因為結晶水比例不同，或者陽離子有差異。草酸鈣難溶于水，中藥飲片水提物中草酸鈣含量應該極低。另外，上述配方顆粒難溶部位的紅外光譜中也有1080、460 cm-1附近的硅膠特征峰，但是1200～1000 cm-1區域的峰形狀有一定差異，說明這些樣品中可能含有硅酸鹽雜質。上述配方顆粒產品中同時存在難溶性草酸鹽與難溶性硅酸鹽，可能是因為生產過程中提取液沒有充分濾凈。

圖3 含有草酸鹽的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

如圖4 所示，廠家B 當歸配方顆粒、廠家D 黨參配方顆粒的難溶部位紅外光譜均含有1640 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶峰和1530 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶峰，說明其中均含有蛋白質類成分，可能是浸膏中可溶性蛋白質在后續生產過程（如干燥過程）發生變性。此外，廠家B 當歸配方顆粒難溶部位含有麥芽糊精，也說明其生產過程可能導致多種成分溶解性變化。上述2 個配方顆粒難溶部位紅外光譜均有1320 cm-1附近的草酸鹽吸收峰，但是1640 cm-1附近的草酸鹽吸收峰與蛋白質酰胺Ⅰ帶峰相互重疊。廠家D 黨參配方顆粒難溶部位的524、469 cm-1吸收峰顯示了硅酸鹽的存在。硅酸鹽（523、464 cm-1）與硅膠（456 cm-1）特征峰有明顯區別，這說明廠家D 黨參配方顆粒中應當沒有添加微粉硅膠，而是可能因為固液分離不凈而在浸膏中遺留有難溶性硅酸鹽。

圖4 含有蛋白質的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

圖5 顯示了A、B、C 3 個廠家生產的茯苓配方顆粒的難溶部位紅外光譜。對照圖4 顯示的麥芽糊精紅外光譜可知，廠家C 茯苓配方顆粒難溶部位主要是麥芽糊精。比較1200～900 cm-1區域的紅外光譜吸收峰特征可知，A和B 2個廠家的茯苓配方顆粒難溶部位與茯苓飲片相似，主要由難溶性的β-葡聚糖組成，而890 cm-1附近即為典型的β-葡萄糖苷鍵特征峰[13]。這說明A 和B 2個廠家的茯苓配方顆粒可能含有固液分離不凈或其他原因遺留的難溶性飲片粉末。此外，廠家B 茯苓配方顆粒難溶部位紅外光譜還有明顯的1610、1313、779 cm-1等草酸鈣水合物特征峰，也說明其產品中可能遺留有難溶性飲片粉末。

圖5 含有多糖的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

圖6 所示為幾種配方顆粒的難溶部位與硬脂酸鈣（CaC36H70O4）的紅外光譜。硬脂酸鈣的紅外光譜中2916、2849 cm-1分別為亞甲基C-H 反對稱和對稱伸縮振動吸收峰，1600～1400 cm-1區域為羧酸根離子C-O 伸縮振動吸收峰與亞甲基和甲基C-H 彎曲振動吸收峰的重疊結果。廠家A 和廠家C 的金銀花配方顆粒、廠家D 黃芪配方顆粒的難溶部位紅外光譜中2916、2849 cm-1附近吸收峰與硬脂酸鈣基本一致，廠家D 黃芪配方顆粒難溶部位紅外光譜中能直接觀察到1576、1540 cm-1附近的硬脂酸鈣特征峰，說明這些樣品均添加硬脂酸鈣作為輔料。

圖6 含有硬脂酸鹽的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

綜上所述，中藥配方顆粒產品中普遍存在難溶性物質，而且化學組成較為復雜，不同廠家、不同品種的中藥配方顆粒難溶性物質各有差異。一些難溶性物質來自輔料，如硅膠、硬脂酸鈣、麥芽糊精等；另一些難溶性物質來自飲片，如草酸鹽、硅酸鹽、蛋白質、多糖等。飲片提取后的生產環節可能改變原有可溶性成分的溶解度，也可能因為固液分離不凈等導致配方顆粒產品含有原本存在于飲片中的難溶性成分。

3.2 中藥配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜分析

中藥配方顆粒水溶液以極性分子為主，所以大部分樣品的三氯甲烷萃取液中固形物極少，僅含有一些甲基、亞甲基較多的分子。但是，如圖7 所示，廠家D 黃芪配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜與PEO 高度一致，說明該配方顆粒中添加了PEO 作為輔料。本研究過程中發現，該廠家其他批次的黃芪配方顆粒也存在添加PEO的情況。

圖7 含有PEO的中藥配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜

3.3 中藥配方顆粒水溶部位的紅外光譜分析

麥芽糊精是中藥配方顆粒普遍添加的輔料，部分產品中麥芽糊精含量超過50%。中藥配方顆粒不經分離而直接進行紅外光譜檢測時，借助化學計量學方法可以比較準確地定量檢測其中的麥芽糊精[14-15]。如果樣品中麥芽糊精含量較低而且沒有可用的多元校正模型，可以利用溶劑分離方法提高紅外光譜定性檢測麥芽糊精的靈敏度。中藥配方顆粒水溶液的醇沉沉淀（本研究中稱為水溶部位，圖1）是多糖類成分較為富集的部位，因此是檢測麥芽糊精或其他多糖類成分的首選。如圖8 所示，不同品種配方顆粒的水溶部位紅外光譜均與麥芽糊精非常相似，說明中藥配方顆粒普遍添加麥芽糊精，而且麥芽糊精含量明顯超過中藥自身多糖含量。如果要檢測中藥配方顆粒所含的藥物多糖，必須排除麥芽糊精的影響。

圖8 含有麥芽糊精的中藥配方顆粒水溶部位的紅外光譜

3.4 典型配方顆粒樣品的不同溶劑部位紅外光譜分析

廠家D 黃芪配方顆粒不同溶劑部位的紅外光譜見圖9。配方顆粒樣品不經分離而直接進行檢測時，其紅外光譜是全部成分吸收信號的疊加，含量較高、信號較強的成分占據主導，含量較低、信號較弱的成分不易觀察。由圖9 可知，該黃芪配方顆粒整體紅外光譜的主要吸收信號來自乙醇部位，也就是既溶于水、又溶于70%乙醇的小分子化合物。該黃芪配方顆粒乙醇部位的紅外光譜與無定形蔗糖非常相似，液相色譜測試發現該黃芪配方顆粒的蔗糖質量分數達到30%。因此，可以基本確定該黃芪配方顆粒整體與乙醇部位的紅外光譜主要特征與無定形蔗糖一致。根據廠家D 提供的數據，該黃芪配方顆粒中麥芽糊精含量為29%。但是麥芽糊精的紅外光譜吸收信號區域與蔗糖高度重疊，所以在該配方顆粒整體紅外光譜上很難直觀發現麥芽糊精特征峰，而水溶部位的紅外光譜與麥芽糊精（圖8）高度相似。該黃芪配方顆粒的難溶部位明顯含有硬脂酸鈣（圖6），而三氯甲烷部位明顯含有PEO（圖7）。雖然硬脂酸鈣與PEO的含量較低，但是該配方顆粒整體紅外光譜上仍然可以觀察到2918 cm-1附近的硬脂酸鈣特征峰與1341 cm-1附近的PEO 特征峰。綜上所述，廠家D 黃芪配方顆粒的整體紅外光譜顯示其含有大量無定形蔗糖，還可能添加硬脂酸鈣與PEO。溶劑分離后的紅外光譜可以確認硬脂酸鈣與PEO 的存在，還可以確認麥芽糊精的存在。

圖9 某黃芪配方顆粒不同溶劑部位的紅外光譜

4 結論

中藥配方顆粒可以看作單味中藥飲片水提物與輔料的混合物。基于液相色譜或氣相色譜檢測技術的指紋圖譜（特征圖譜）是對中藥配方顆粒所含有機小分子化合物進行整體控制的必備手段。此外，中藥配方顆粒含有的難溶性物質、高分子化合物可能影響有機小分子化合物的溶出、溶解、吸收過程，某些情況下難溶性物質、高分子化合物本身就屬于藥效物質。因此，建立難溶性物質與高分子化合物的化學表征方法，對于更加全面整體地評價中藥配方顆粒質量是較為必要的。根據紅外光譜能夠直接檢測固體樣品和高分子樣品的技術特點，本研究選擇紅外光譜表征中藥配方顆粒難溶性物質與高分子化合物的化學結構。為了提高檢測靈敏度和專屬性，本研究采取先用系統溶劑分離、后用紅外光譜檢測的技術路線。

本研究的結果表明，紅外光譜與系統溶劑分離相結合可以明顯提高檢測靈敏度和專屬性，有效識別中藥配方顆粒所含難溶性物質與高分子化合物。三氯甲烷部位的紅外光譜可以發現親脂性高分子輔料（如PEO），而水溶部位的紅外光譜可以發現親水性高分子輔料（例如麥芽糊精）。難溶部位的紅外光譜既可以發現硅膠、硬脂酸鈣等無機輔料，又可以發現草酸鹽、硅酸鹽、蛋白質、多糖等藥物自身成分，反映了分離、干燥、制粒等生產環節對中藥配方顆粒藥物組成及其理化性質的影響。因此，紅外光譜可以與液相色譜、氣相色譜等分析技術相互結合，更加全面地表征中藥配方顆粒的化學成分，更加完善地評價中藥配方顆粒的質量水平。