基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和GEO數(shù)據(jù)集的翻白草治療2型糖尿病分子機制探討

何旭，馬鑫彥，趙薇，張印江，魯碧楠*，龐宗然*

1.中央民族大學 藥學院，北京 100081；

2.民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，北京 100081；

3.大理白族自治州人民醫(yī)院 藥劑科，云南 大理 671000

全球疾病負擔數(shù)據(jù)顯示，全球約有4.62 億人患2 型糖尿病（T2DM），相當于世界人口的6.28%，預計2030 年，全球T2DM 患病率將達到7.08%，T2DM 已成為全球健康領(lǐng)域的一種公共衛(wèi)生負擔[1-2]。近30 年來，我國糖尿病患病率明顯上升，2015—2017 年我國18 歲以上人群糖尿病患病率上升至11.2%，T2DM 患者占糖尿病人群的90%以上[3-4]。糖尿病發(fā)病率高、合并癥多、用藥周期長及傳統(tǒng)降糖藥物的不良反應等問題給糖尿病的防治帶來巨大的挑戰(zhàn)。

翻白草Potentilla discolorBge.因葉片面青背白而得名，為薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬植物翻白草的帶根全草，其味甘、微苦，性平，歸肝、胃、大腸經(jīng)。翻白草是涼山彝族人民長期使用的一種藥物，彝族語稱為“期濤景”，彝族醫(yī)將其用于治療瘧疾、痢疾、風濕痛和月經(jīng)不調(diào)等[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，翻白草具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種活性[6-10]。Meta分析結(jié)果表明，翻白草提取物能夠顯著降低T2DM 小鼠的血糖水平及血清中膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）的含量[11]。翻白草總黃酮可以顯著改善T2DM db/db 小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，減輕肝臟和胰腺組織的病理損傷，通過降低血清中空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）、TC、TG、空腹血胰島素（FINS）、丙二醛（MDA）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，提高肝臟組織磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路中胰島素受體底物-1（IRS-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）蛋白表達水平和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt，發(fā)揮防治T2DM作用[12]。此外，翻白草水提物能夠降低高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導的T2DM 小鼠肝臟中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）mRNA 水平，增加糖原合酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化，通過調(diào)節(jié)糖異生和糖原合成來改善肝葡萄糖穩(wěn)態(tài)[13]。民間偏方中翻白草代茶飲能夠降低血糖，目前已有翻白草治療T2DM的臨床報道，30～100 g·d-1開水沖泡代茶飲，能夠取得較好的治療效果，顯著降低T2DM 患者的空腹血糖和餐后2 h血糖水平[14-15]。但目前尚缺乏對翻白草治療T2DM 作用機制的全面和系統(tǒng)的研究。鑒于此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合GEO 數(shù)據(jù)集探討翻白草治療T2DM 的分子機制，為翻白草的臨床應用提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 T2DM GSE系列獲取

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“type-2 diabetes mellitus”“DM2”“T2DM” 詞條進行檢索，來源選擇“Homo sapiens”，系列類型選擇“Expression profiling by array”，獲取符合條件的GSE系列。

1.2 T2DM差異基因分析

使 用R 4.2.1（https://www.r-project.org/）中GEOquery程序包對基因芯片數(shù)據(jù)進行下載，提取表達矩陣，對原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，采用normalizeBetweenArrays 函數(shù)對數(shù)據(jù)進行歸一化處理后提取臨床信息。

使用FactoMineR 和factoextra包對正常對照組和T2DM 組數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA），使用limma程序包對兩組進行差異基因分析，界定條件為|log2FC|＞1（FC為差異倍數(shù)）且P＜0.05，繪制火山圖。

1.3 翻白草作用靶點預測

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索翻白草化學成分[16]，在SwissADME 數(shù)據(jù)庫中根據(jù)化學結(jié)構(gòu)，結(jié)合口服生物利用度和類藥性五原則對各成分進行篩 選[17]，在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）中選擇種屬為“Homo sapiens”，預測各成分的可能作用靶點[18]。在微生信在線平臺獲取T2DM 差異基因和藥物作用靶點的交集，即為翻白草治療T2DM的潛在作用靶點。

1.4 生物信息學分析

取T2DM 差異基因和翻白草作用靶點的交集，用clusterProfiler、ggplot2、ggthemes、enrichplot 包，以P＜0.05 作基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。采用Cytoscape 3.9.1（https://cytoscape.org/）構(gòu)建化學成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 潛在作用靶點驗證

根據(jù)KEGG 通路分析結(jié)果，確定潛在作用靶點及靶點所對應的翻白草化學成分。PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載潛在作用靶點的3D 結(jié)構(gòu)，PyMol 2.5 軟件（https://pymol.org/2/）對其進行去水和去殘基處理，PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化學成分的2D 結(jié)構(gòu)并在Chem3D 軟件中轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)后，以潛在作用靶點作為受體，化學成分作為配體，經(jīng)AutoDockTools 1.5.6 軟件（https://ccsb.scripps.edu/mgltools/）進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 T2DM差異基因分析

選擇GSE7014 表達芯片數(shù)據(jù)，該芯片集包含6個正常樣本和20個T2DM樣本，由PCA結(jié)果（圖1A）可知，正常組和T2DM 組顯示出較好的組內(nèi)重復性和組間區(qū)分度。T2DM 差異基因分析結(jié)果見火山圖（圖1B），共有差異基因658 個，其中445 個為表達上調(diào)基因，213個為表達下調(diào)基因。

圖1 T2DM GSE7014表達芯片數(shù)據(jù)分析

2.2 翻白草治療T2DM的潛在作用靶點

TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到翻白草化學成分20 個，各成分通過SwissADME篩選和SwissTargetPrediction靶點預測，共納入靶點785 個（表1），去除重復靶點411個，得到藥物作用靶點374個。藥物作用靶點與T2DM 差異基因取交集，得到翻白草治療T2DM的潛在作用靶點17 個，其中9 個表達水平上調(diào)，8個表達水平下調(diào)（表2）。

表1 翻白草中20 個化學成分經(jīng)SwissADME 篩選和SwissTargetPrediction預測結(jié)果

表2 翻白草治療T2DM潛在靶點信息

2.3 富集分析與靶點-化學成分-通路分析

2.3.1 富集分析結(jié)果 對17 個潛在作用靶點進行GO 富集分析，以P＜0.05 為界定條件，選取生物過程、細胞組分和分子功能各自的前5 項，用R 軟件相應程序包進行富集分析（表3），細胞組分沒有富集到顯著差異的結(jié)果。涉及的生物過程主要有細胞內(nèi)受體信號通路、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)節(jié)、細胞氨基酸分解代謝過程、端粒封頂?shù)恼蛘{(diào)節(jié)。分子功能主要有氧化還原酶活性 [作用于以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）為受體的供體的醛或氧基團]、結(jié)合轉(zhuǎn)錄共激活劑、氧化還原酶活性（作用于供體的醛或氧基團）、核受體活性和配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性。

表3 翻白草治療T2DM靶點的GO富集分析

KEGG 通路分析結(jié)果表明，P＜0.05 的通路共有12 條，選取前8 條通路（P＜0.01）作分析，其中與T2DM 關(guān)系密切的有胰島素抵抗通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路和脂肪細胞因子信號通路，參與的基因有PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB和PFKFB3（表4）。

表4 翻白草治療T2DM靶點的KEGG通路分析

2.3.2 化學成分-靶點-通路分析 翻白草治療T2DM 的主要成分有原兒茶酸、咖啡酸、山柰酚、3,4,5-三羥基苯甲酸、羅索酸等，通過作用于PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3 等靶點來發(fā)揮治療作用。構(gòu)建化學成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 翻白草治療T2DM靶點的化學成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.4 分子對接驗證

將靶點作為受體，與之對應的翻白草化學成分作為配體進行分子對接，根據(jù)親和力大小，選取與PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3結(jié)合性能最強的治療T2DM 的化學成分，作分子對接模式圖（圖3）。

圖3 翻白草治療T2DM靶點與化學成分分子對接模式

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學能夠揭示藥物化學成分-靶點-通路的整體調(diào)節(jié)機制，對藥物與疾病的相關(guān)性進行預測，明確藥物治療疾病的分子機制。與已報道的翻白草抗糖尿病的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法相比[19]，本研究方法的不同之處在于借助GEO 數(shù)據(jù)庫檢索出T2DM 基因芯片的GSE 系列，利用R 軟件統(tǒng)計出健康人群和T2DM 患者的差異基因，并對化學成分和潛在靶點進行分子對接驗證。本研究結(jié)果表明，翻白草治療T2DM 的可能有效成分有咖啡酸、羅索酸、山柰酚、原兒茶酸和3,4,5-三羥基苯甲酸等，分別作用于PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3等靶點，通過調(diào)控胰島素抵抗通路、脂肪細胞因子信號通路和HIF-1信號通路來發(fā)揮治療T2DM作用。

胰島素抵抗是T2DM 的關(guān)鍵致病因素，表現(xiàn)為胰島素靶向組織對胰島素生理水平的反應性降低，機制與外周組織中異位脂肪堆積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、炎癥、活性氧水平、腸道微生物群紊亂、脂肪因子調(diào)節(jié)失調(diào)等相關(guān)[20-21]。PKC 家族由3 個不同的群體組成，即常規(guī)的（α、βⅠ、βⅡ、γ）、新穎的（δ、ε、η、θ）和非典型的（ζ、λ）。PKC 是絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過抑制胰島素受體底物的絲氨酸磷酸化，導致胰島素信號通路中斷，從而導致胰島素抵抗[22]。PKC-θ分布在免疫系統(tǒng)中，可以促進免疫細胞分泌白細胞介素-10（IL-10）。IL-10在糖尿病發(fā)展中表現(xiàn)出關(guān)鍵作用，敲除PKC-θ可減少小鼠體內(nèi)IL-10的分泌，減少胰島β細胞質(zhì)量和胰島素分泌[23]。肝臟PKC-ε和骨骼肌PKC-θ活性增加，可使TG和二酰甘油含量顯著升高，進而引起肝臟和肌肉胰島素抵抗[24]。RPS6KA3 是與胰島素抵抗相關(guān)的hsa-miR-33a-5p 的靶基因[25]，核糖體S6 激酶（RSK）是參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白激酶家族。在正常組大鼠和糖尿病組大鼠中，胰島素能夠顯著增加各組大鼠后肢骨骼肌中細胞外調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）、p90核糖體S6激酶（RPS6KA3 或RSK2）、Akt 和p70S6 激酶（p70S6k）的活性，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的RSK2 表達和胰島素刺激的RSK2活性顯著升高[26]。S-烯丙基半胱氨酸可以通過調(diào)節(jié)MEK1/2-ERK1/2-RSK2 信號通路發(fā)揮對鏈脲佐菌素-煙酰胺誘導的大鼠糖尿病腎病的改善作用[27]。

糖脂代謝紊亂是T2DM 發(fā)展的重要原因[28]，STAT3 是T2DM 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，miR-125a-5p 作為糖脂代謝的調(diào)節(jié)劑，通過靶向STAT3調(diào)控SREBP-1c和PI3k/Akt 通路來抑制肝臟脂質(zhì)生成和糖異生，提高糖原合成[29-30]。LDHB 是調(diào)節(jié)SCL2a6 下游乳酸代謝的因子，控制著乳酸和丙酮酸之間的轉(zhuǎn)化，在血糖控制不良的糖尿病患者中，LDHB和PGK1的表達都是上調(diào)的[31]，SLC2a6 通過靶向LDHB 調(diào)節(jié)糖酵解，因此SLC2a6-LDHB軸可作為治療糖尿病相關(guān)肌肉萎縮的潛在靶點[32]。PFKFB3介導的糖酵解，對缺血肢體具有顯著的保護作用[33]。HIF1-PFKFB3 途徑與糖尿病胰島病理學密切相關(guān)，PFKFB3 驅(qū)動糖酵解會損害神經(jīng)元的抗氧化能力，導致神經(jīng)元丟失和反應性膠質(zhì)細胞增生，HIF1-PFKFB3 信號通路是糖尿病視網(wǎng)膜病變中多種細胞類型中普遍存在的病理成分，基于該通路靶向的代謝干預點值得在糖尿病視網(wǎng)膜病變中進一步考慮[34-35]。RELA 也被稱為p65，是構(gòu)成NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子家族的5 種成分之一，誘導p65 NF-κB 和STAT3 的去磷酸化和脫乙酰化，能夠減少高葡萄糖引起的氧化應激，細胞凋亡，炎癥反應和上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)移的進展[36]，抑制p65 NF-κB在體內(nèi)和體外的磷酸化，可以有效緩解db/db小鼠的腎損傷[37]。

作為資源豐富、成分多樣、藥理作用明確的民族藥物，彝族藥翻白草具有良好的開發(fā)應用前景。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合GEO 數(shù)據(jù)集探討了翻白草治療T2DM 的潛在靶點和可能作用機制，揭示翻白草是通過多成分-多靶點-多通路協(xié)同發(fā)揮作用的，從理論層面預測翻白草治療T2DM 的可能分子機制，后續(xù)將采用體內(nèi)實驗進行深入研究。