基于分子模擬技術篩選寬體金線蛭抗凝活性肽△

華羽彤，李尹，董瑞娟，郭秀歡，雷艷，辛泉誠，魏鵬，袁瑞娟

北京中醫藥大學，北京 102488

中藥動物藥水蛭是臨床上常用的抗凝藥物，具有抗凝、溶栓、改善人體血液流變性等功能[1]，其來源有螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman及柳葉螞蟥W.acranulataWhitman[2]。水蛭素是從水蛭新鮮唾液中提取出的抗凝活性肽，是目前已知抗凝效果最強的天然凝血酶抑制劑。螞蟥又稱寬體金線蛭，是中藥水蛭的主要來源，但在寬體金線蛭中未檢測出水蛭素，然而其在臨床應用中具有明確抗凝功效，目前有研究報道從寬體金線蛭中提取出的抗凝成分大部分是多肽或蛋白類物質，然而其氨基酸序列尚不清楚[3]，導致寬體金線蛭抗凝物質基礎尚不明確[4]。

隨著分子模擬計算及生物信息學的快速發展，利用虛擬技術輔助篩選活性成分在中藥物質基礎研究中發揮了關鍵作用，可節省大量時間及實驗成本。分子對接能明確成分與已知靶點的相互作用方式及結合強弱，分子動力學模擬能進一步判斷成分與已知靶點之間結合的穩定性。本課題組在前期研究基礎上已建立寬體金線蛭蛋白質庫[5]。本研究擬利用虛擬酶切技術構建寬體金線蛭多肽候選庫，將酶切所得多肽與凝血酶進行分子對接初篩，并對結合能高的復合物進行分子動力學模擬復篩，根據MM-PBSA 計算結合自由能確定目標抗凝肽，最后合成目標抗凝肽并進行體外抗凝活性測定，為寬體金線蛭抗凝物質基礎研究提供新思路。

1 材料

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 型四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；6125B型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；ChromCore120 C18Naco Chrom 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；SC40 型半自動凝血分析儀（中勤世帝生物技術有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，Thermo Fisher 公司，批號：F22M9J202）；三氟乙酸（分析純，北京邁瑞達科技有限公司，批號：C1830007）；烏拉坦（分析純，天津市光復精細化工研究所，批號：A41906130119）；TT 試劑盒（中勤世帝生物技術有限公司，批號：STY20301-35-6）。

1.3 實驗動物

健康日本大耳白兔，1只，體質量2.5 kg，雄性，購于北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司，動物許可證號為SCXK（京）2020-0002，符合國家健康一級動物標準。本研究所涉及的動物相關實驗操作符合實驗動物倫理要求，并獲得北京中醫藥大學動物倫理委員會批準（審批號：BUCM-2022010806-0008）。

2 方法

2.1 虛擬酶切及多肽毒性預測

本課題組前期利用轉錄組對寬體金線蛭進行基因研究，確定以Helobdella robusta（Californian leech，1 種加利福尼亞水蛭）庫為基準進行蛋白組研究，后利用同位素標記相對與絕對定量技術（iTRAQ）蛋白組學進行寬體金線蛭的蛋白成分分析，最終得到寬體金線蛭蛋白質庫。針對本課題組前期得到的寬體金線蛭蛋白質庫[5]，利用SIB 瑞士生物信息學研究所的生物信息學資源平臺（https://web.expasy.org/peptide_mass/）[6]，選擇酶切方式為胰蛋白酶，將蛋白進行虛擬酶切以得到寬體金線蛭所含多肽，并通過在線網站ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）預測虛擬酶切后多肽的毒性、突變設計和理化性質[7]。

2.2 凝血酶-多肽分子對接

分子對接以凝血酶為靶點，預測無毒性多肽為配體進行對接。從PDB 蛋白質結構數據庫（RCSBPDB，https://www.rcsb.org/）中提取凝血酶（PDB：2BVR）的結構，利用HPEPDOCK 服務器[8]（http://huanglab.phys.hust.edu.cn）進行全局分子對接，在Discovery Stuido 2016 中使用CDOCKER 以蛋白晶體結構（PDB：2BVR）中已有配體的殘基TYS18 為活性部位中心進行半柔性對接[9]。選擇水蛭素變體（GDFEEIPEEYLQ）為陽性對照[10]，后根據對接分數篩選多肽進行分子動力學模擬。其中，蛋白晶體結構（PDB：2BVR）中已有配體與本實驗所選陽性對照均為水蛭素變體，但由于氨基酸TYS 不屬于20種常見氨基酸，無法實現不同方式的分子對接，故選擇另一水蛭素變體（GDFEEIPEEYLQ）作為本實驗的陽性對照。

2.3 分子動力學模擬

利用生物分子建模和模擬平臺（CHARMMGUI，https://charmm-gui.org/）構建凝血酶-多肽的復合物構象。分子動力學模擬使用GROMACS 2018.33 軟件進行[11]，水分子采用TIP3P 模型[12]。采用最陡下降法對體系進行模擬和優化，以減少整個體系的不合理接觸或原子重疊；然后進行受限分子動力學模擬，進行5 ns 的等溫等壓系綜（NPT）平衡過程，使模擬系統達到完全預平衡。采用Verlet LeapFrog 算法求解牛頓運動方程，積分步長設為2 fs。在計算過程中，繪制Lennard-Jones函數來計算范德華力（VDW），非鍵截止距離設置為1.2 nm；Lincs 算法約束所有原子的鍵長，粒子網格Ewald（PME）方法計算短程靜電相互作用。所有分子動力學模擬都是在等溫等壓系綜下進行的，熱力學溫度為310.15 K，壓力為101.325 kPa。溫度和壓力由V-Resale 和Parrinello-Rahman 方法控制。溫度和壓力耦合常數分別為0.1、0.5 ps。分子動力學模擬時間設置為50 ns，并進行3 個獨立樣本模擬，使用PYMOL 2.5.0 軟件[13]生成可視化和圖形。

2.4 MM-PBSA計算

通過對利用分子對接篩選得到的穩定復合物進行MM-PBSA 計算[14]，得到凝血酶-多肽的結合自由能。MM-PBSA 計算通過GROMACS 進行，設置介電常數pdie值為1，其余參數為默認項，本研究結合能在整個50 ns 時間段內每間隔100 ps 進行采樣，從軌跡中產生500幀進行計算。

2.5 多肽固相合成及純度驗證

將利用分子模擬技術篩選得到的多肽交由吉爾生化（上海）有限公司進行固相合成，并利用高效液相色譜法（HPLC）進行純度驗證，利用四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）進行多肽相對分子質量確定。多肽用水溶解后，進行HPLC 測定，流動相為0.1%三氟乙酸乙腈溶液（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，26%～51%A）；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為220 nm，進樣體積為10 μL。質譜檢測條件為負離子模式，流動相為水-乙腈（50∶50），電噴霧電離源（ESI），流速0.2 mL·min-1。

2.6 兔貧血小板血漿（PPP）的制備

向健康兔耳緣靜脈注射25%烏拉坦（0.9%氯化鈉溶液配制）致其麻醉，麻醉劑量為4 mL·kg-1，頸動脈插管取血至裝有3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑（9∶1）的離心管中，輕輕顛倒后，立即3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為2.795 cm），取得PPP備用。

2.7 抗凝血酶活性測定

將合成多肽利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，終質量濃度分別為1、10、20、30、40 mg·mL-1。以比伐盧定作陽性對照，利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，終質量濃度分別為0.3、0.5 μg·mL-1。取PPP，將多肽/比伐盧定與血漿以1∶9 加樣，以50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）為空白對照，利用TT 試劑盒，在半自動凝血分析儀中進行抗凝活性測定。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 寬體金線蛭蛋白組的虛擬酶切及毒性預測

用胰蛋白酶對課題組前期得到的寬體金線蛭112 條蛋白進行虛擬酶切，酶切結果及毒性預測結果見表1，最終酶切所得多肽共3365 條，其中預測無毒性多肽3317條用于后續實驗研究。

表1 寬體金線蛭蛋白酶切所得多肽數

3.2 凝血酶-多肽分子對接

將相對分子質量為1000～2000 Da 的無毒性多肽利用HPEPDOCK服務器進行全局對接，發現部分結合位點與水蛭素變體結合位點相同，且全部多肽均能對接成功。根據Weng 等[15]利用14 個對接軟件對蛋白-多肽進行分子測評結果，發現HPEPDOCK 全局對接方式更適用于蛋白-多肽對接，結合本研究結果，說明全局對接位點具有更高的選擇性，對接成功的可能性更大。

根據HPEPDOCK 的結果和文獻報道[16]，將蛋白晶體結構（PDB：2BVR）中已有配體的殘基TYS18定義為活性位點，并用Discovery Studio 對全局對接分數較高的多肽進行半柔性對接（CDOCKER）。根據對接分數及多肽與凝血酶相互作用的氨基酸殘基類型和數量，最終篩選出了31 條多肽進行下一步分子動力學模擬，以考察其結合穩定性，其中凝血酶與無毒性多肽CDOCKER 對接能量分數＞對照的31條多肽的分子對接結果見表2。

表2 凝血酶與無毒性多肽分子對接結果

3.3 凝血酶-多肽復合體的分子動力學模擬分析

對3.2 項下篩選出的31 條多肽分別進行了凝血酶-多肽復合物的分子動力學模擬（50 ns），以研究其對凝血酶的影響。

通過研究在50 ns的整個軌跡中主干與初始對接結構的均方根偏差（RMSD）來分析凝血酶-肽復合體的動態穩定性，結果見表3。其中多肽QNTVGLDDFFSSYER（6）及QIEEAEEIAAVNLAK（16）利用HPEPDOCK 進行對接的復合物的RMSD值低于0.3 nm，故對以上2個多肽的復合物進行分子動力學50 ns的重復。結果顯示，QNTVGLDDFFSSYER多肽3 次分子動力學RMSD 值均值分別為0.211、0.261、0.284 nm，QIEEAEEIAAVNLAK 多肽3 次分子動力學RMSD 值均值分別為0.276、0.354、0.455 nm，QNTVGLDDFFSSYER 多肽3 次重復樣本間波動較小（圖1A），且含有凝血酶的復合物在整個模擬過程中保持高度穩定，平均RMSD 值為0.2 nm（圖1B）。說明該多肽與凝血酶結合更加穩定，故選擇QNTVGLDDFFSSYER 多肽進行后續研究，下文以WP-antithrombin-pep命名。

圖1 凝血酶-多肽QNTVGLDDFFSSYER分子動力學模擬50 ns軌跡RMSD值（n=3）

表3 50 ns內凝血酶-多肽復合物分子動力學RMSD nm

氫鍵是蛋白質和多肽之間的關鍵驅動力，有助于提高絡合結合能力和穩定性。分別用LigPlot 2.2.5軟件[13]說明了分子動力學模擬前后凝血酶與WP-antithrombinpep復合物的親水和疏水相互作用（圖2）。

圖2 凝血酶與WP-antithrombin-pep相互作用2D圖

經過對接后，發現凝血酶與WP-antithrombinpep 的殘基Leu130-Thr3、Leu130-Thr3、Arg233-Asp8、Asp178-Arg15、Asn179-Arg15、Arg101-Glu14 和His91-Glu14 之間形成了7 個氫鍵及16 個疏水作用，其中殘基Leu130-Thr3 之間形成了2 個氫鍵。在經過50 ns 分子動力學模擬后，氫鍵數量明顯增多，凝血酶 與WP-antithrombin-pep 的殘基Arg233-Tyr13、Arg233-Asp8、Arg233-Ser12、Phe232-Tyr13、Glu164-Gln1、Asp178-Arg15、Arg165-Asn2、Val163-Thr3、Gln131-Gln1 和Ala132-Gln1 之間形成了10 個氫鍵及11 個疏水作用。其中Arg233-Asp8、Asp178-Arg15依舊通過氫鍵作用穩定結合。表明凝血酶殘基Arg233、Asp178 在與WP-antithrombin-pep 的靜電相互作用中起重要作用。

在得到的3D結構中（圖3A），WP-antithrombinpep結合到凝血酶的活性溝槽上，采用部分α-螺旋構象。Arg233 與Asp8、Arg233 與Ser12、Asp178 與Arg15、Arg165 與Asn2、Glu164 與Gln1 之間的靜電相互作用被突出顯示并標記。凝血酶與WP-antithrombinpep 復合體的庫侖相互作用能約為-700 kJ·mol-1，遠低于蘭納-瓊斯勢能，后者在整個模擬過程中穩定在-200 kJ·mol-1（圖3B），表明靜電力是凝血酶與WP-antithrombin-pep復合體結合的驅動力。

圖3 凝血酶與WP-antithrombin-pep相互作用3D圖及勢能分析

3.4 MM-PBSA結果分析

利用MM-PBSA 計算進一步分析凝血酶與WPantithrombin-pep 的相互作用，得到的總自由結合能由范德華能、靜電能、極性溶劑化能和溶劑可及表面能組成，其中范德華能為-（257.614±36.087）kJ·mol-1，靜電能為-（2 789.063±227.564）kJ·mol-1，為（2 656.745±196.673）kJ·mol-1，溶劑可及表面能為-（37.574±3.144）kJ·mol-1，凝血酶與WP-antithrombinpep的總結合自由能為-（427.506±83.634）kJ·mol-1，且對500 幀總結合自由能進行繪圖，見圖4，發現總結合能在50 ns內趨于穩定，說明該復合物結合穩定。

圖4 凝血酶與WP-antithrombin-pep在50 ns模擬軌跡中500幀樣本總結合自由能

3.5 多肽合成結果

采用HPLC 對合成的WP-antithrombin-pep 進行純度檢測及質譜相對分子質量檢測，結果見圖5、圖6，具體出峰時間及峰面積見表4，通過峰面積計算含量，其純度為98.878%。由圖6 可知，在質荷比為591.50及887.60處產生了分子碎片，最終確定相對分子質量為1 777.84 Da，為高純度肽，可以用于后續實驗。

圖5 WP-antithrombin-pep合成多肽HPLC圖

圖6 WP-antithrombin-pep合成多肽二級質譜圖

表4 WP-antithrombin-pep的HPLC定量結果

3.6 WP-antithrombin-pep能延長凝血酶時間（TT）

TT 用于評價藥物對凝血途徑中共同途徑的影響作用，凝血酶位于共同途徑上，故本研究用TT驗證WP-antithrombin-pep 的抗凝活性。研究結果見圖7，WP-antithrombin-pep延長TT 的作用隨多肽質量濃度的增加而增強，在WP-antithrombin-pep 質量濃度為20 mg·mL-1，即在體系中質量濃度為1000 μg·mL-1時，TT值與空白對照組相比差異有統計學意義。比伐盧定陽性對照在體系中質量濃度為0.015 μg·mL-1時，TT 值與空白對照組相比差異有統計學意義，這表明WP-antithrombin-pep 可以作用于共同凝血途徑，具有抗凝活性。

圖7 WP-antithrombin-pep在體系中不同質量濃度下對TT的影響（±s,n=3）

4 討論

動物類中藥是中藥的一大組成部分，蛋白質、多肽等大分子是其重要活性物質基礎。蛋白進入胃腸道后經胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶降解得到大量多肽，傳統的分離方法難以快速篩選出有效的抗凝活性肽，得到抗凝活性肽的序列，分子對接和分子動力學是一種借助計算機虛擬模擬受體和配體之間相互作用方式的手段，有望快速從中藥中篩選得到具有靶向性的抗凝活性肽。

分子對接可以探索構象空間，展示蛋白質與多肽的相互作用，預測多肽-蛋白質的結合親和力。分子對接結果直接取決于分子對接軟件的選擇，市面上對于蛋白-多肽對接的軟件相對較少，故本研究采用HPEPDOCK 蛋白-多肽對接軟件及CDOCKER 蛋白-小分子對接軟件進行多肽篩選。根據表3 結果顯示，分子動力學模擬后，HPEPDOCK 對接的凝血酶-肽復合物的平均RMSD 整體低于CDOCKER 對接的復合體，HPEPDOCK 屬于全局對接，其對接位點較CDOCKER對接更廣泛，表明HPEPDOCK可能產生更好的結合。Weng等[15]利用14個分子對接軟件對蛋白-多肽進行對接性能測試，發現在全局對接中，HPEPDOCK 對接性能最好，且提出使用多種不同的多肽初始構象進行對接是成功的關鍵。表明在進行蛋白-多肽分子對接時，首選蛋白-多肽分子對接軟件，并且要綜合考慮多肽及受體蛋白的柔性，以提高蛋白-多肽結合成功率。

利用分子對接及分子動力學能明確凝血酶與多肽QNTVGLDDFFSSYER 相互作用的具體方式，利用MM-PBSA 可以預測蛋白-多肽的結合自由能，對結合情況進行進一步判斷。3D 結構及2D 相互作用圖均顯示，凝血酶Arg233、Asp178 殘基是凝血酶與多肽QNTVGLDDFFSSYER 結合的主要殘基。在分子動力學前后，凝血酶Arg233與多肽Asp8、凝血酶Asp178 與Arg15 殘基之間一直通過氫鍵作用緊密結合。凝血酶Arg233、Asp178 殘基均位于凝血酶的Exosite 2 結構域上，與Arg165 殘基共同組成三聯體殘基離子簇，對凝血酶與血栓調節蛋白的結合產生影響[17]。Exosite 2 更易結合帶負電荷的配體[18-19]，Asp8為酸性殘基，更易與Arg233殘基結合。提示凝血酶Arg233 殘基可能是多肽與凝血酶結合的關鍵氨基酸，且多肽中含有酸性殘基（如Asp、Glu）越多，則與凝血酶形成穩定結合的可能性越大。

本研究通過虛擬酶切技術，將課題組前期得到的寬體金線蛭蛋白進行酶切，得到寬體金線蛭多肽候選庫。利用分子對接技術及分子動力學技術進行兩步篩選，篩選出了1 條多肽（QNTVGLDDF FSSYER），并對該多肽進行TT 測定，發現該多肽能延長凝血酶時間，其體內抗凝活性有待進一步深入研究。