異槲皮苷對β-淀粉樣蛋白誘導毒性的阿爾茨海默病轉基因秀麗隱桿線蟲模型的神經保護作用△

李冰琪，侯曉夢，楊揚，劉傲雪，李強

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029

阿爾茨海默病（AD）是一種常見的神經系統退行性疾病，是老年癡呆的最常見原因之一。AD 對60 歲以上患者的致殘率大于卒中、肌肉骨骼疾病、心血管疾病和癌癥[1]，除了對患者生活的影響外，還給家人帶來了巨大的心理和經濟負擔。目前，可用于治療AD 的藥物相對不足，開發新藥物與新療法迫在眉睫。AD 主要由淀粉樣β蛋白（Aβ）沉積引起，會出現腦組織萎縮、神經損傷等病理現象[2]。所以，AD 的防治應該從抑制Aβ的沉積、促進損傷神經的再生著手。

中醫認為，癡呆疾病是由腎虛氣弱導致。補腎益精法是癡呆治療的基本原則，攝入補腎藥可以一定程度上對大腦退化起到延緩甚至抑制作用[3]。腎精充足，可上充髓海，而中醫所言之髓海之精從功能上與腦中的神經干細胞非常接近。通過本課題組對補腎中藥菟絲子的研究發現[4]，從菟絲子中分離出的異槲皮苷促體外神經干細胞增殖活性顯著，說明異槲皮苷對改善AD 等神經退行性疾病具有潛在的藥用價值。

秀麗隱桿線蟲CL4176（以下簡稱線蟲）是AD相關研究常用的實驗動物模型，為溫度誘導型轉基因株，在16 ℃的溫度下可正常生長，當溫度升高到25 ℃時，Aβ被強烈誘導表達，從而導致蟲體出現癱瘓[5-6]。因此，本研究考察了異槲皮苷對線蟲CL4176壽命和Aβ誘導毒性的潛在影響，并闡明其發揮神經保護作用的可能機制，為治療AD 的新藥研發提供依據。

1 材料

1.1 菌株、線蟲

轉基因線蟲CL4176由北京中醫藥大學中藥學院譚鵬課題組提供；大腸埃希菌Escherichia coliOP50由北京中醫藥大學中藥學院劉永剛課題組提供。

1.2 儀器

SPX-250 型生化培養箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ECLIPSE Ts2R 型熒光倒置顯微鏡、SMZ745 型體視顯微鏡（尼康映像儀器銷售中國有限公司）；Multiskan FC 型酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；GTR10-2型高速冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）；VORTEX-7 型渦旋振蕩儀、LX-300型離心機、QL-902型渦旋振蕩儀均購于海門其林貝爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SII 型高溫高壓滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；VD650 型超凈工作臺（浙通品牌有限公司）；ABI 7500 型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Applied Biosystems 公司）；NanoDrop? ND-2000型分光光度計（Thermo Scientific 公司）；Tanon 1600 型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；Sub-Cell GT-1704486型水平電泳槽（Bio-Rad公司）。

1.3 試劑

2-(3,6-二乙酰氧基-2,7-二氯-9H-氧雜蒽-9-基)苯甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）；NaOH、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaH2PO4、CaCl2、NaClO、KOH 均為分析純（北京試劑有限公司）；瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、膽固醇、鹽酸咪唑（Innochem 公司）；二喹啉甲酸（BCA）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 線蟲的培養及同步化

4 mol·L-1NaOH 溶液-H2O-NaClO（1∶1∶8）混合制備裂解液，挑出處于繁殖期的線蟲，用M9 緩沖液將其沖下轉移至離心管中，靜置沉降再去掉上清液，加入裂解液1 mL 使其裂解充分，將蟲卵轉移至新的培養皿中培養。

2.2 藥物配制

配制含有E.coliOP50 的固體培養基NGM 作為模型組。取異槲皮苷20 mg，用去離子水1 mL溶解，作為母液。給藥組在模型組NGM 中加入異槲皮苷，配制質量濃度為100.00、25.00、6.25 μg·mL-1的含藥固體培養基。

2.3 癱瘓實驗

將繁殖期的線蟲放置在含有E.coliOP50 的NGM板上產卵。每次處理在每個平板上保留大約50個蟲卵，并在16 °C 下孵育2 d。同步化的線蟲卵在16 °C 下培養至L3 時期，隨機挑選線蟲并放入給藥組與模型組中，每個培養皿的線蟲數量控制在50 條左右。然后將線蟲轉移至25 ℃培養箱，溫度變化刺激Aβ的表達，Aβ聚集導致線蟲癱瘓。每2 h 在顯微鏡下觀察線蟲癱瘓情況。線蟲的癱瘓特征為在觀察期間只有頭部擺動而身體不動，甚至用鉑絲觸碰線蟲的身體后依然不動。

2.4 壽命實驗

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數量控制在30 條，16 ℃為線蟲正常生長時的溫度，培養2 d后轉移至25 ℃恒溫培養箱誘導Aβ表達。每天計算線蟲的存活或死亡情況，直到最后1 條線蟲死亡，線蟲死亡判斷標準為對鉑絲的溫和刺激沒有反應或沒有表現出咽部泵送運動。每隔2 d將線蟲轉移至新的培養基培養，統計每個培養皿中線蟲存活數量，直到所有線蟲死亡時終止計數。

2.5 運動能力測定

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中，加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數量控制在50 條，保持溫度在16 ℃下培養4 d。為了防止線蟲培養過程中出現食物不足的情況，需要2 d換1次培養基。將各組培4 d后的線蟲用M9緩沖液沖洗3 次，靜置使其沉降，吸去上清液，轉入新的培養基進行培養。從各組隨機挑取10 條線蟲，每次在體視顯微鏡下觀察1 條，對線蟲身體彎曲次數進行統計，計時時間為30 s。

2.6 吞咽頻率測定

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中，加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數量控制在50 條，線蟲置于16 ℃培養箱培養4 d后，隨機挑取10 條線蟲對線蟲的吞咽次數進行觀察并計數，每次在體式顯微鏡下觀察1 條，線蟲頭部位置的咽泵上下跳動時則計為完成1 次吞咽，計時時間為20 s。

2.7 活性氧（ROS）含量測定

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲數量控制在30條，16 ℃培養36 h，然后將線蟲轉移至25 ℃培養箱處理36 h。將各組培養好的線蟲用M9緩沖液沖下轉移至離心管中，靜置沉降再棄掉上清，在暗棕色離心管中加入2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），將DCFH-DA 探針的終濃度控制在20 μmol·L-1，每管中加入100 μL 左右，實驗需要避光操作且在室溫下孵育2.5 h。隨后在熒光倒置顯微鏡下觀察線蟲，調整好顯微鏡拍攝熒光圖片（激發波長485 nm，發射波長530 nm），實驗結束后用Image J軟件對每組線蟲的熒光強度值進行測量。

2.8 抗氧化酶含量測定

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數量控制在30 條，保持溫度在16 ℃下培養2 d，之后將線蟲轉移至25 ℃培養箱中繼續培養2 d。將各組培養好的線蟲用M9 緩沖液沖下轉移至離心管中，靜置沉降再棄掉部分上清液，4 ℃下用自動勻漿器勻漿，12 000 r·min-1離心4～5 min（離心半徑為13 cm），取上清液，按照試劑盒的說明書測定各組線蟲的蛋白質、MDA含量和SOD、CAT活性。

2.9 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測mRNA表達

將線蟲同步化至L3 期，在加藥組與模型組培養基中加入隨機挑取的處于L3 期的線蟲。保持溫度為16 ℃培養1 d，之后將線蟲轉移至25 ℃培養箱中繼續培養4 d。通過Trizol 法獲取線蟲的總RNA，操作步驟嚴格遵循說明書，SYBR Green 作為DNA 熒光染料，通過qRT-PCR 對目標基因的表達進行測定，以actin-1為內參測定daf-16及其下游靶基因的表達量，相對定量結果采用2-△△Ct法進行計算，以擴增效率為100%計算基因表達量差異。引物設計見表1。

表1 線蟲基因qRT-PCR擴增引物設計

2.10 數據統計

所有計量資料均使用SPSS 25.0 統計學軟件處理，數據結果用（±s）表示。采用單因素（ANOVA）檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。事后比較時，方差齊者用Tukey，方差不齊者用Tamhane'sT2。采用Origin 2022軟件進行數據作圖。

3 結果

3.1 癱瘓實驗

與模型組比較，異槲皮苷對線蟲的僵化速率有一定的延緩作用（圖1）。質量濃度為6.25 μg·mL-1的異槲皮苷處理后，線蟲僵化速率達到50%的時間（PT50）[7]延長了11.0 h（P＜0.001）。這表明異槲皮苷可以緩解Aβ蛋白沉積對線蟲的毒性作用。因此后續實驗選用6.25 μg·mL-1作為異槲皮苷給藥質量濃度。

圖1 異槲皮苷對線蟲非癱瘓率的影響

3.2 壽命實驗

結果顯示，模型組線蟲的平均壽命為（7.556±0.667）d，最長壽命為11 d（圖2）。異槲皮苷組線蟲平均壽命為（9.956±0.583）d，最長壽命為14 d；與模型組相比，異槲皮苷給藥能顯著延長線蟲壽命，延長率為31.7%（P＜0.01）。

圖2 異槲皮苷對線蟲生存率的影響

3.3 運動能力

運動能力下降說明線蟲本身的機體功能受到影響，其整體活躍程度能夠通過運動能力這一重要指標反映出來[8]。模型組線蟲30 s 內身體彎曲次數為18.30±2.36，異槲皮苷給藥4 d后，線蟲身體彎曲次數為25.40±1.89，與對照組比較增加了38.79%（P＜0.001）。

3.4 吞咽頻率

線蟲的吞咽速率在正常生理狀況下能夠反映出線蟲進食的能力，進而間接反映線蟲的機體功能是否衰退[9]。實驗第4 天，模型組線蟲20 s 內吞咽次數為38.70±2.45、異槲皮苷組線蟲20 s 內吞咽次數為40.90±1.91；第6 天模型組線蟲20 s 內吞咽次數為32.30±4.01、異槲皮苷組線蟲20 s 內吞咽次數為35.50±1.96。與模型組比較，異槲皮苷組線蟲吞咽頻率差異無統計學意義，說明異槲皮苷并未對線蟲的攝食能力產生影響。

3.5 ROS含量

極高ROS 水平會導致氧化應激，這是誘導AD神經退行性級聯反應的主要機制之一[10]。模型組線蟲體內相對熒光強度為2.645±0.188，異槲皮苷組線蟲體內相對熒光強度為0.676±0.043。與模型組比較，異槲皮苷組線蟲體內ROS 水平明顯降低（P＜0.001），熒光圖見圖3。這表明異槲皮苷在線蟲體內能夠表現較強的抗氧化能力，可能通過改善氧化應激發揮抗AD的作用。

圖3 線蟲體內ROS水平熒光圖

3.6 抗氧化酶活性

抗氧化酶在減少氧化損傷中起著重要作用[11]。模型組與異槲皮苷組線蟲體內SOD 活力分別為（13.376±0.162）、（24.451±0.216）U·mg-1；CAT活力分別為（1.540±0.005）、（8.895±0.014）U·mg-1；MDA 含量分別為（14.558±0.022）、（6.421±0.016）nmol·mg-1。由于SOD、CAT 是線蟲體內主要的抗氧化酶，線蟲抗氧化能力的變化可以通過酶活力的升高或降低來表現。異槲皮苷處理能使CL4176 線蟲體內的SOD、CAT 活力顯著提高（P＜0.01，P＜0.001）。MDA 的堆積具有一定的細胞毒性，是脂質過氧化終產物。MDA 含量可以反映生物體內脂質過氧化的程度，間接反映出細胞受損情況。實驗研究結果表明，給藥組線蟲體內MDA的含量相較于模型組顯著降低（P＜0.001），表明異槲皮苷組在一定程度上能夠提高線蟲體內抗氧化能力，緩解氧化損傷。

3.7 熒光定量PCR檢測

與對照組相比，異槲皮苷給藥組線蟲的AβmRNA 表達量顯著降低，經異槲皮苷處理后線蟲體內daf-16轉錄水平提高了3.2 倍，下游sod-3轉錄水平提高2.3 倍；熱激蛋白基因hsf-1轉錄水平提高3.9 倍；skn-1轉錄水平提高3.3 倍，下游gst-4轉錄水平提高2.1 倍；抗氧化酶基因ctl-1轉錄水平提高3.1 倍，可見經異槲皮苷處理后，CL4176 線蟲應激抗性能夠有所增強（圖4）。

圖4 異槲皮苷對相關基因的qRT-PCR檢測結果（±s,n=3）

4 討論

AD 是一種常見的與衰老相關的神經退行性疾病，其主要致病因素是Aβ寡聚體的錯誤折疊和形成，導致不溶性聚集體，最終導致神經元損傷[12]。線蟲是篩選和發現抗AD 藥物的理想模式生物，因為其具有簡單但有代表性的神經系統、生命周期短、遺傳特征較為完善和藥物消耗劑量低[13]。此外，通過構建轉基因線蟲的AD 模型，可以研究Aβ參與病理行為的直接影響[14]。

Aβ基因表達會導致線蟲出現僵化表型，本研究通過線蟲癱瘓實驗篩選出異槲皮苷最佳活性質量濃度，實驗結果表明，異槲皮苷處理后能夠延緩線蟲CL4176僵化，最佳質量濃度為6.25 μg·mL-1。異槲皮苷處理后，能夠顯著延長在25 ℃條件下誘導產生Aβ的CL4176 線蟲的生存時間，同時線蟲PT50延長了11.0 h（P＜0.001）。異槲皮苷對線蟲吞咽速率并沒有顯著影響，不存在飲食限制問題，但能夠增強線蟲的運動能力。并且異槲皮苷能夠顯著降低線蟲體內ROS 含量，提高SOD、CAT 活性，降低線蟲體內MDA 含量，說明異槲皮苷能夠顯著增強其氧化抗性。

有研究表明，突變導致的胰島素受體功能喪失能夠延長線蟲壽命[15]。其中，與胰島素/胰島素樣生長因子1 信號通路（IIS）相關的DAF-16、SKN-1 和HSF-1 轉錄因子至關重要。DAF-16 作為IIS/IGF-1 通路的下游靶標，是發育、繁殖、新陳代謝、應激反應和壽命的中央調節因子，并且能正向調節SKN-1和HSF-1的活性[16]。HSF-1是調節熱應激和蛋白質折疊穩態的關鍵轉錄因子。HSF-1 和DAF-16/FoxO 通過與編碼小熱休克蛋白的基因啟動子中的熱休克元件（HSEs）和DAF-16/FoxO 結合元件（DBEs）結合延緩衰老[17]。轉錄因子SKN-1 是抗氧化活性和異源防御的重要調節因子，通過飲食限制或抑制TORC1或TORC2途徑延長線蟲壽命[18]。研究結果表明，異槲皮苷依賴并能夠通過激活中央調節因子DAF-16，同時激活關鍵的氧化應激調節劑SKN-1 并依賴于SKN-1 來延長線蟲的壽命。且異槲皮苷還通過激活HSF-1提高了抗熱應激能力。

總體而言，上述結果表明，異槲皮苷依賴并作用于IIS，通過增加應激抵抗力，尤其是抗氧化能力，延長了線蟲模型的壽命并延緩了神經退行性疾病的進展。

綜上，本研究為異槲皮苷抗AD 的深入研究提供了一定的理論依據。但本研究尚有不足之處，線蟲體內Aβ蛋白的表達水平及其聚集形態的觀察指標還需要進一步研究。