基于多元統計學方法的維藥沒食子藥材紅外光譜研究△

楊青青，米爾扎提·麥麥提，陳星，趙璐，馬璇，

1.新奇康藥業股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；

2.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830054；

3.新疆奇沐醫藥研究院，新疆 烏魯木齊 830011

沒食子是殼斗科植物沒食子樹Quercus infectorinOliv.幼枝上的干燥蟲癭，是由沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriaeOliv.寄生而成，主要產于地中海沿岸阿拉伯、土耳其、巴基斯坦等地區[1]。沒食子藥用歷史悠久，是維吾爾族醫常用藥，維吾爾藥物名為莫扎。沒食子藥性溫，入肺、脾、腎經，具有固氣、澀精、斂肺、止血的功效[2]。以沒食子為原料，采用現代制劑工藝生產的西帕依固齦液，是國家基本藥物目錄品種，在臨床用于治療口腔疾病，包括牙齦出血腫痛、牙齒松動、咽喉腫痛、瘡瘍腐爛、傷口不愈等。

沒食子化學成分復雜，主要含有固醇類、黃酮類、生物堿類、鞣質類、揮發油、皂苷、蒽醌類等[3]。在這些成分中，以鞣質為主，占總成分的50%～70%[4-5]，迄今，已確定了約10 種鞣質類化合物[4]。中藥化學組成復雜，常用的定量檢測方法只測定其中的1 種或者幾種成分，存在著一定局限性；另外，采用大型精密儀器測定多成分含量的成本較高，檢測樣品需要進行前處理、建立方法較費時、整體操作繁瑣，且過程中使用一定毒性試劑的情況較多，長期使用對環境不利。紅外光譜技術具有靈敏度高、特征性強、快速、無損等特點，具有較強的整體性、客觀性、科學性，能反映藥材內部復雜成分峰的疊加，一定程度上也可以反映藥材大類成分及其比例，故可較全面地體現藥材的質量。有關沒食子藥材的紅外鑒別結合多元統計分析在其質量差異方面的研究未見報道。因此，本研究構建了不同來源沒食子藥材的紅外光譜，采用二階導數紅外光譜和多元統計相結合的方法對25 批沒食子藥材進行了鑒別，以補充其鑒別信息，使研究結果能夠相互印證，為分析和評價其質量差異提供參考。

1 材料

1.1 樣品

沒食子藥材共25批（編號S1～S25），其中S1～S5來源于廣西玉林市、S6～S10 來源于廣東廣州市、S11～S15來源于安徽亳州市，采購時間為2019—2021年；S16～S20產于伊朗哈吉阿巴德、S21～S25產于土耳其約茲加特，采購時間為2018—2020 年。所有藥材經新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克主任藥師鑒定，均為殼斗科植物沒食子Gall ofQuercus infectoriaOliv.。

1.2 試藥

溴化鉀（光譜純，批號：20200408）、無水乙醇（分析純，批號：20220528）均購于天津市鑫鉑特化工有限公司；水為純凈水。

1.3 儀器

Spectrum Two 型傅里葉變換紅外分光光度計（美國PekinElmer 公司）；YP-15 型粉末壓片機[中世沃克（天津）科技發展股份有限公司]；FW-80 型粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）；ME204T型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

2 方法與結果

2.1 紅外光譜的建立

2.1.1 樣品制備與數據處理 除去沒食子藥材中的雜質，粉碎，200 目過篩，密封保存，存放在干燥處。將沒食子樣品粉末3 mg與干燥溴化鉀300 mg研磨混合；將混合好的樣品150 mg 放入專用壓片模具中，以30 MPa壓制3 min，得到1塊均勻、半透明的薄片，同法制備溴化鉀作為空白片。數據處理通過利用Spectrum 5.0.1 軟件，二階導數紅外光譜處理參數：平滑點13。

2.1.2 測定條件 傅里葉變換紅外分光光度計掃描范圍為4000～400 cm-1，設置自動扣除CO2和H2O 的干擾，掃描頻率為16 次/s，掃描速度0.2 cm·s-1，光譜分辨率4 cm-1，實驗室環境溫度為25～30 ℃，相對濕度為25%～40%。

2.1.3 精密度試驗 將沒食子樣品（編號S1）的粉末按2.1.1 項下的步驟配制，按2.1.2 項下條件，連續測6 次，并用Spectrum 軟件進行紅外光譜圖對比。結果表明，該方法的紅外光譜相關系數分別為1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.997 1、0.998 6、0.998 1，RSD 為0.11%，說明該方法的精密度較好。

2.1.4 重復性試驗 取沒食子樣品（編號S1）的粉末6 份，按2.1.1 項下方法配制供試樣品片，按2.1.2 項下條件進行測定，并用Spectrum 軟件進行紅外光譜圖對比。結果顯示，譜間相關系數為1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.996 2、0.996 2、0.995 5，RSD為0.16%，表明方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗 將沒食子樣品（編號S1）粉末體按2.1.1 項下方法配制成試樣，置于干燥器中，分 別在0、30、60、90、120、150、180 min，按2.1.2 項下方法測定，并用Spectrum 軟件進行紅外光譜圖對比。結果顯示，譜間相關系數分別為1.000 0、0.997 8、0.995 0、0.992 3、0.989 9、0.987 2、0.986 6，RSD為0.52%。說明該樣品在常溫下放置180 min，其穩定性較好。

2.1.6 紅外光譜數據分析 采用2.1.1 項下方法，將25 批食子樣品粉末制成供試樣品片，并按2.1.2項下條件進行測定，利用Spectrum 軟件采集以上藥材樣品的紅外光譜圖進行比對，共獲得25 批沒食子藥材的紅外光譜圖，結果見圖1。研究表明，25 批次沒食子樣品的紅外光譜圖的相關系數為0.932 7～0.995 6；所得的紅外光譜圖峰形、峰位基本相似，表明不同來源的沒食子藥材中的化學成分相近，所含的特征峰和形態基本相同，而指紋區（900～1800 cm-1）則有明顯的差別。利用OMNIC 8.2軟件對25批沒食子樣品的紅外光譜圖進行了分析，并將其透過率轉化為吸光度，從而得出了不同來源沒食子藥材的平均紅外光譜圖，見圖2。

圖1 25批沒食子藥材樣品的紅外透過率疊加光譜

圖2 不同來源沒食子樣品的平均紅外光譜圖

將不同產地沒食子進行吸光度處理后，發現25批沒食子藥材樣品有18個峰（圖2）。中藥沒食子粉末主要在3380、2928、2832、2714、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1197、1081、1027、868、757、651、590、526 cm-1附近出現吸收峰。O-H 基的伸縮振動值為3650～3200 cm-1，是判斷是否存在醇類、酚類和有機酸的主要依據。當醇和酚溶于非極性溶劑（如CCl4），在3650～3580 cm-1處出現游離O-H 基的伸縮振動吸收峰，峰形較尖，不受其他吸收峰的影響，容易辨認。隨著樣品濃度的增大，羥基化合物出現結合現象，O-H 基的伸縮振動吸收峰向低波數偏移，并在3400～3200 cm-1處形成了一個較大的吸收峰[6-7]；在該實驗中，3400～3200 cm-1的大吸收峰是分子間氫鍵O-H 伸縮振動吸收峰。在3000 cm-1以下，存在著飽和C-H 伸縮振動，而在3000～2800 cm-1處，取代基對C-H 伸縮振動偏移影響不大；在2928 cm-1處，是亞甲基C-H 反對稱伸縮振動吸收峰；在2832 cm-1處，是亞甲基C-H 的對稱伸縮振動吸收峰[8-9]。在2714 cm-1處存在醛基伸縮振動吸收峰。在1900～1650 cm-1處，C=O 產生伸縮振動，這是一種非常典型的紅外光譜，可以很好地分辨出酮類、醛類、酸類、酯類及酸酐等有機物質。由于振動耦合作用，酸酐的羰基吸收帶呈現出雙峰。在1718 cm-1處，吸收峰為C=O伸縮振動峰，如羧酸類和酯類[10]。在1612、1448 cm-1處對應苯環骨架伸縮振動的吸收峰，結合1718 cm-1位置的峰特征，推測其為鞣質類化合物，與文獻中所報告的沒食子中所含的化學成分相符[2,11-13]。1534 cm-1主要表現為N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動，是蛋白酰胺Ⅱ帶吸收峰[10]。1374 cm-1的譜帶為甲基的C-H 對稱彎曲振動。結合1718 cm-1處酯羰基，1197 cm-1可能為丙酸伸縮振動峰。譜圖中1300～1100 cm-1處存在較強的C-O 吸收峰，1900～1650 cm-1具有較強的C=O 吸收峰，這說明其為典型的羧酸酯類化合物。在1081、1027 cm-1處，吸收峰為糖類和糖苷類成分中的C-O 伸縮振動峰。糖環振動吸收峰值為1000～800 cm-1，糖骨架振動吸收峰值為1200～1000 cm-1[14-15]，沒食子藥材紅外光譜峰歸屬詳見表1。

表1 沒食子藥材紅外光譜峰歸屬

2.1.7 沒食子的二階導數紅外光譜分析 二階導數紅外光譜可以分離出原光譜中的一些相互重疊的吸收峰，從而提高了譜的分辨率。從圖3 可以看出，在2928、2832 cm-1的亞甲基伸縮振動吸收峰原光譜中并不明顯，在紅外導數圖譜中，可以很明顯地確認。1800～1600 cm-1沒食子二階導數圖可以將其在原譜圖上重疊的紅外吸收峰區別開，出現具有特征的三峰等。在1580～1420、1200～950 cm-1波段的譜峰特征有明顯增加，1362 cm-1處在原光譜中不明顯的肩峰在二階導數圖譜中表現出了不同來源沒食子的差異性。

圖3 沒食子藥材不同來源平均二階導數紅外光譜圖

2.2 正態分布分析

以1027 cm-1最大吸收峰值為參考，通過Spectrum軟件對共有峰峰高進行歸一化處理，得出了1 個共有峰的相對峰高，由于3380 cm-1是O-H 的吸收峰，在1900～1700 cm-1處以酯類成分為主，在1700～1500 cm-1處以酸類成分為主，在1200～800 cm-1處以糖類成分為主，其余4個波數是沒食子藥材紅外光譜中最強的吸收峰，在上述3個波段內，選取了6個共有峰進行了分析。由圖4可知，1612 cm-1處5個不同來源沒食子藥材樣品區分開來，采用Microsoft Excel 2016軟件，以不同來源沒食子藥材樣品1612 cm-1處吸收峰的相對峰高比值為橫、縱坐標繪制正態分布曲線，見圖5。由圖5可知，廣西和安徽沒食子藥材的正態分布曲線不相交，說明兩者之間的質量有顯著的差別；中國廣西、廣東的沒食子藥材與伊朗來源的沒食子藥材正態分布曲線有相交，說明它們之間的樣品質量接近。

圖4 不同來源沒食子樣品中6個共有峰的相對峰高

圖5 不同來源沒食子樣品的正態分布曲線

2.3 聚類分析

從25 批沒食子藥材樣品18 個峰中選取11 個特征 峰（3380、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1081、1027、868、757 cm-1附近處吸收峰），以其相對峰強度為原始數據，將數據導入SPSS 22.0軟件進行分析，采用組間連接法，以平方Euclidean距離為分類依據，對樣品進行系統聚類分析，見圖6。由圖6可知，當組間距離為10～15時，25批沒食子藥材樣品可聚為4 類，其中S1、S2、S4、S5、S9、S11、S13、S16、S17、S19、S24 聚為一類，S6、S7、S8、S10、S12、S15、S18、S20、S21、S22、S23聚為一類，S3、S25聚為一類，S14聚為一類。

圖6 25批沒食子藥材樣品的聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析

主成分分析是多個變量變換以選出較少重要變量的一種統計學方法，目前已被廣泛用于數據統計分析[16]。以25 批沒食子藥材樣品中11 個特征峰的相對強度為原始數據，通過SPSS 22.0 軟件進行降維因子分析。結果顯示，前4 個主成分的累積方差貢獻率為89.565%＞85%，充分地反映沒食子樣品中11個特征峰的基本特征和主要信息，故選取特征值＞1的前4 個主成分特征值，分別為4.659、2.736、1.920、1.433（表2），前4 個因子斜率陡峭，后趨于平緩（圖7），故將前4 個因子作為主成分進行分析。按公式（1）計算綜合得分，綜合得分是以各主成分的方差貢獻率為權重，對主成分得分和對應權重進行加權平均，可反映沒食子藥材的質量，較高得分表示其質量較好。在25 批沒食子藥材中，廣西來源的綜合得分最高，而安徽來源的綜合得分最低，結果見表3。

表2 25批沒食子藥材主成分特征值與方差貢獻率

表3 25批沒食子藥材樣品的綜合得分

圖7 沒食子藥材的主成分分析碎石圖

式中A1（主成分1）、A2（主成分2）、A3（主成分3）、A4（主成分4）是4個主成分的新變量名。

2.5 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

將25 批沒食子樣品共有峰的相對峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，進行OPLS-DA，結果見圖8，25批沒食子樣品可很好地聚類為4 類，與聚類分析、主成分分析結果一致。提取OPLS-DA 模型中11 個變量的變量重要性投影（VIP）值并從大到小排序，以VIP 值＞1 為引起沒食子藥材批次間差異的主要標志性成分，是區分樣品最關鍵的色譜峰，對樣品分類作用較大[17-19]，結果見圖9。共篩選出5 個影響沒食子藥材質量的關鍵波數，其VIP 值從大到小對應的波數依次為1614（1.316 3）、1373（1.117 4）、1535（1.082 2）、1027（1.070 6）、1079（1.025 1）、1448（1.012 4）cm-1，其中1614、1535 cm-1處為酸類成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1處為糖苷類成分的特征吸收峰。

圖8 25批沒食子藥材樣品的OPLS-DA得分圖

圖9 25批沒食子藥材共有峰波數的VIP值

3 討論

傅里葉變換紅外光譜是鑒別化學物質結構常用的方法，將其應用于中藥類鑒別可避免復雜的樣品前處理，且具有快速、樣品無損等優點，可以對中藥所含化學物質進行整體、有效地分類識別。本研究建立了紅外光譜法測定沒食子藥材的方法，并進行了方法學考察，結果顯示，該方法的精密度高、重復性好、在0～180 min 內穩定性較好。同時，在進行該方法的建立時，還考察了樣品的壓片情況，試驗了100、150、200 mg 壓片，結果表明，100 mg的樣品量較少，壓片成形性不好；200 mg 壓的片較厚，透明度較差；150 mg 壓片成型與透明度較好，最后，確定了壓片使用的樣品量為150 mg。此外，還考察了樣品與溴化鉀壓片的比例（1∶100、1∶150、1∶200），其中1∶100的比例效果最佳。

通過對25 批沒食子藥材樣品正態性分析可知，廣西來源與安徽來源沒食子藥材質量存在明顯差異，中國廣西、廣東來源沒食子藥材與伊朗來源藥材樣品質量相近。聚類分析將波數相似大的藥材聚為一類，結果聚為4 類。根據主成分分析結果可知，廣西來源沒食子藥材的綜合得分最高，安徽來源沒食子藥材的綜合得分最低。OPLS-DA 模型與聚類分析結果一致，VIP值分析得到了5個影響沒食子藥材質量的關鍵波數，其中1614、1535 cm-1處為鞣質類、蛋白質類成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1處為糖苷類成分的特征吸收峰。

本研究結果顯示，沒食子紅外光譜圖、二階導數紅外光譜、結合正態分布、聚類分析、主成分分析和OPLS-DA，結果相互補充和印證，該方法可對不同來源的沒食子藥材進行快速鑒別，本研究結果豐富了沒食子藥材的質量評價體系，為藥材鑒別提供了一種新的方法。