混合模式層析分離純化超螺旋質(zhì)粒DNA

張鵬程, 譚遠(yuǎn)志, 孫艷娜, 張其磊, 姚善涇, 林東強(qiáng)

混合模式層析分離純化超螺旋質(zhì)粒DNA

張鵬程, 譚遠(yuǎn)志, 孫艷娜, 張其磊, 姚善涇, 林東強(qiáng)

(浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江省智能生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310058)

針對(duì)細(xì)胞裂解液中的超螺旋質(zhì)粒DNA (sc pDNA)的分離，以質(zhì)粒pVAX1為典型對(duì)象、采用Capto PlasmidSelect作為混合模式層析介質(zhì)，探討了料液中主要成分sc pDNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA (oc pDNA)和RNA的吸附行為，優(yōu)化了分離條件，實(shí)現(xiàn)了從成分較為復(fù)雜的料液中高效分離sc pDNA。考察了上述3種組分的靜態(tài)吸附，發(fā)現(xiàn)在(NH4)2SO4濃度(NH4)2SO4為1.9～2.5 mol×L-1時(shí)，sc pDNA均具有較高的吸附量，確定(NH4)2SO4=2.5 mol×L-1的料液可直接上樣，此時(shí)sc pDNA飽和吸附量為每克介質(zhì)吸附3.3 mg。動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sc pDNA穿透略晚于oc pDNA，sc pDNA動(dòng)態(tài)載量為每毫升介質(zhì)負(fù)載2.00 mg，RNA吸附能力明顯強(qiáng)于pDNA。進(jìn)一步優(yōu)化了洗脫、沖洗和上樣量等分離條件，采用(NH4)2SO4=2.5 mol×L-1上樣、(NH4)2SO4=1.9 mol×L-1沖洗、((NH4)2SO4=1.7 mol×L-1)+(NaCl= 0.3 mol×L-1)洗脫，sc pDNA純度可達(dá)83.9%、同質(zhì)性高達(dá)95.8%、收率為80.6%。結(jié)果表明，混合模式層析對(duì)sc pDNA選擇性好、處理量較大，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

超螺旋質(zhì)粒DNA；吸附；混合模式層析；核酸分離

1 前 言

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因治療在生物醫(yī)藥領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注，目前已有多個(gè)基因治療產(chǎn)品獲得美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)或歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)[1]。

質(zhì)粒DNA(pDNA)是一種小型環(huán)狀DNA，在基因治療中可以作為DNA疫苗直接參與疾病防控，也可以作為病毒載體或mRNA等藥物的生產(chǎn)原料[2]。pDNA存在三種不同構(gòu)象：超螺旋(supercoiled，sc)，開環(huán)(open circular，oc)和線性(linear，ln)。作為基因治療藥物，pDNA存在轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn)，大約1 000個(gè)分子中只有1個(gè)能進(jìn)入細(xì)胞并被表達(dá)[3]。……