福建平和蜜柚皮多糖酶解提取工藝的優化

王睿寧，胡宇鑫，陳強，黃哲，楊帆

（福州大學至誠學院，福建 福州 350002）

福建平和蜜柚[Citrus maxima（Burm）Merr]是琯溪蜜柚的品種之一[1]，產量逐年上升，據統計年均產量已突破150 萬t[2]，產值突破100億元[3]。相較于逐年上升的產值，亟需解決的問題也越來越多。蜜柚食用或加工后的副產物果皮廢棄物丟棄問題嚴重，造成固體廢棄物的污染[4]，蜜柚果皮未得到充分利用。實際上蜜柚不僅果肉味美、鮮爽可口[5]，其果皮富含活性多糖、果膠、膳食纖維等成分，具有較高的營養價值和食用價值[6]。基于柚子皮潛在的活性成分與功能，柚子皮越來越受到研究者的關注。大量研究表明，柚子皮的主要成分之一活性多糖具有降血脂、降膽固醇和抑制菌體病毒生長等作用[7-10]。柚子皮粉能改善帶魚肌原纖維蛋白的凝膠特性，可作為改善魚肉及其制品品質的添加劑[11]。此外，柚子皮還有止咳化痰的功效[12]，其大量的未知成分還有待開發利用[13]。但是對于柚子皮的綜合利用開發還處在試驗階段，未形成產業化、規模化的生產。因此，開發利用柚皮資源，如提取多糖、香精油、果膠、黃酮等活性物質，獲取蜜柚高附加值，將成為研究者的重要任務，這也是柚子產區柚子果品加工廠亟需解決的問題[6]。目前，關于對柚子皮中黃酮提取工藝的研究最多[14-15]，其次是柚子皮多糖的研究[16-17]，但選取的原料都是常山胡柚皮[16-17]，對于福建平和蜜柚的研究鮮見報道。本研究以福建平和蜜柚皮為原料，利用酶解提取柚子皮多糖，并通過響應面法確定福建蜜柚多糖提取的最佳工藝條件[18-21]。本研究將有利于解決福建蜜柚果皮造成的固體廢棄物的問題，提高蜜柚的原料利用率，有利于福建地方經濟的發展，以期為蜜柚皮廢棄化利用的開發與研究提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與試劑

福建平和蜜柚：市售；果膠酶（30 000 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；木瓜蛋白酶（＞50 萬U/g）：北京奧博星生物技術有限公司；無水乙醇、95%乙醇（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；超純水：湖南科爾頓水務有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；DHG-9245A 鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；RE-5205 旋轉蒸發儀：上海昕儀儀器儀表有限公司；CTFD-10S 冷凍干燥機：青島永合創信電子科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柚子皮多糖酶解提取工藝流程

稱取自然風干的柚子皮10 g 置于錐形瓶中，加入液料比15∶1（mL/g）的95%乙醇在恒溫水浴鍋中處理2 h，經過濾、干燥備用。柚子皮與水按液料比混合，加入0.4%的果膠酶和0.1%的木瓜蛋白酶，置于55 ℃恒溫水浴鍋，提取液經80 ℃水浴滅活、活性炭沉淀（取物料質量的1%，80 ℃維持1 h）、旋轉蒸發儀濃縮（真空度0.95 MPa，65 ℃）至20 mL 后，加入95%乙醇至占溶液體積分數為90%以上，析出粗多糖，4 ℃靜置12 h，過濾，60 ℃干燥1 h，獲得柚子皮多糖固體粉末。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酶用量對柚子皮多糖得率的影響

在液料比15∶1（mL/g）、浸提時間2 h、浸提2 次的條件下，酶用量分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g，考察酶用量對柚子皮多糖得率的影響。每個試驗2 組平行，每組重復3 次。

1.3.2.2 液料比對柚子皮多糖得率的影響

在酶用量0.9 g、浸提時間2 h、浸提2 次的條件下，液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），考察液料比對柚子皮多糖得率的影響。每個試驗2 組平行，每組重復3 次。

1.3.2.3 浸提時間對柚子皮多糖得率的影響

在液料比20∶1（mL/g）、酶用量0.9 g、浸提2 次的條件下，浸提時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同浸提時間對柚子皮多糖得率的影響。每個試驗2 組平行，每組重復3 次。

1.3.3 響應面優化試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，根據響應面Box-Behnken 試驗設計原理，選取酶用量A、液料比B、浸提時間C 3 個對柚子皮多糖提取影響顯著的因子，以柚子皮多糖得率為響應值，采用三因素三水平響應面分析法設計試驗水平因素表，見表1。

表1 試驗因素水平設計Table 1 Levels of test factors

1.3.4 柚子皮多糖得率計算

柚子皮多糖得率的計算公式如下。

W=M1/M0×100

式中：W 為柚子皮多糖得率，%；M1為干燥后多糖固體粉末的質量，g；M0為柚子皮質量，g。

1.4 數據處理

數據分析采用SPSS 19.0 進行單因素試驗結果分析，采用Design Expert 10.0 進行響應面試驗結果分析，圖表繪制采用Origin 8.0 進行制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對柚子皮多糖得率的影響

酶用量對柚子皮多糖得率的影響如圖1 所示。

圖1 酶用量對柚子皮多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖1 可知，柚子皮多糖得率隨酶用量的增加而先升高后降低。酶用量為0.9 g 時，多糖得率最高為2.13%。此后隨著酶用量增加，柚子皮多糖得率反而下降。在溶液反應過程中，果膠酶與底物進行特異性結合，分解果膠內部結構，破壞植物細胞壁釋放多糖[22]。同時酶用量在0.1～0.9 g 時，有利于蛋白質的降解，可提高多糖得率。但酶用量過多，會大大阻礙酶與底物的定向反應，導致酶的催化效率降低，致使多糖得率下降[23]。因此，酶用量的最佳選用范圍為0.7～1.1 g。

2.1.2 液料比對柚子皮多糖得率的影響

液料比對柚子皮多糖得率的影響如圖2 所示。

圖2 液料比對柚子皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖2 可知，柚子皮多糖得率隨著液料比的增加而提高。液料比20∶1（mL/g）時，多糖得率最高2.77%。柚子皮液料比小于20∶1（mL/g）時，柚子皮與酶溶劑的接觸面積和接觸機會也相對變大，能夠使多糖更多的與水分子接觸，更好地溶解在水中[24]。液料比在20∶1～30∶1（mL/g）時，柚子皮多糖得率保持穩定，多糖溶解度一定時，液料比超過一定范圍后，對可溶性多糖的溶解影響減弱。溶劑體積的變化也會造成后續濃縮能耗的增加，因此，液料比的最佳選用范圍為15∶1～25∶1（mL/g）。

2.1.3 浸提時間對柚子皮多糖得率的影響

浸提時間對柚子皮多糖得率的影響如圖3 所示。

圖3 浸提時間對柚子皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖3 可知，在浸提時間0.5～2.0 h 時柚子皮多糖得率隨浸提時間延長而提高。浸提時間2.0 h 時，多糖得率最高為2.73%。在一定時間范圍內，浸提時間越長，多糖的溶解越多，呈現平衡狀態[25]。浸提時間為2.0～3.0 h 時，對多糖得率影響變小，可能是底物與酶完全反應，多糖得率逐漸趨于穩定[26]。因此，浸提時間的最佳選用范圍為1.5～2.5 h。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗分析

在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法設計綜合優化試驗。以柚子皮多糖得率為響應值，以A 酶用量（g）、B 液料比（mL/g）、C 浸提時間（h）3 個因素為因子，設計三因素三水平的中心組合試驗設計，響應面試驗設計結果見表2。

表2 響應面試驗設計結果Table 2 Response surface design of experiments and results

2.2.2 回歸方程建立與分析

以柚子皮多糖得率為響應值，利用DesignExpert10.0軟件對表2 試驗結果進行分析，得到提取條件與多糖得率之間的二次多項式回歸模型：Y=2.71+0.006 25A+0.12B+0.14C+0.063AB+0.045AC+0.007 5BC-0.34A2-0.19B2-0.24C2。

對數據進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可知，回歸模型具有高度顯著性（P＜0.01），證明此模型已達到極顯著水平；失擬項P 值為0.265 7，差異不顯著（P＞0.05）。決定系數R2=0.984 4 說明響應值柚子皮多糖得率與預測值之間擬合較好。校正系數RAdj2=0.964 3，說明模型能解釋96.43%的響應值變化。回歸方程各項方差分析表明，B、C、A2、B2、C2對多糖得率有極其顯著的影響（P＜0.01），A、AB、AC、BC 對多糖得率影響不顯著（P＞0.05）。各因子對多糖得率的影響顯著性依次是C（浸提時間）＞B（液料比）＞A（酶用量）。

2.2.3 兩因子間交互作用分析

響應曲面圖及等高線圖可明晰各因素間的交互作用及確定最佳點。因素影響顯著則3D 曲面圖的曲面坡度越陡峭，平坦則影響不顯著[27]。疏離的橢圓形等高線代表兩因素交互作用顯著，反之，密集的圓形等高線代表交互作用不顯著[28]。各因素的交互作用對柚子皮多糖得率的影響效果如圖4 所示。

圖4 任意兩變量對多糖得率影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions between any two variables on polysaccharide yield

由圖4 可知，固定浸提時間2 h，液料比和酶用量兩因素的響應面傾斜程度較小，等高線呈現近似圓形，說明兩因素交互作用不顯著。響應曲面圖開口向下，說明在試驗所選范圍內存在極大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、酶用量0.9～1.0 g 為最佳水平范圍。

固定液料比20:1（mL/g），酶用量和浸提時間兩因素的響應面傾斜程度較小，等高線呈現圓形，說明兩因素交互作用不顯著。響應曲面圖開口向下，在試驗所選范圍內存在極大值，酶用量0.9～1.0 g、浸提時間1.9～2.1 h 為最佳水平范圍。

固定酶用量0.9 g，液料比和浸提時間兩因素的響應面傾斜程度非常小，等高線為圓形，說明兩因素交互作用不顯著。響應曲面圖開口向下，說明在試驗所選范圍內存在極大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、浸提時間1.9～2.1 h 為最佳水平范圍。

2.2.4 最佳條件的預測及驗證

通過回歸模型的預測，酶解提取柚子皮多糖的最佳工藝參數：酶用量1.039 g、液料比22.195∶1（mL/g）、浸提時間2.181 h，此時多糖得率的理論最大得率為2.79%。考慮到實際生產需求，將工藝參數調整為酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提時間2 h。在此條件下進行3 次平行試驗進行驗證，柚子皮多糖的平均得率為（2.73±0.21）%，與理論預測值誤差值僅為0.06%，證實了該模型的有效性。

3 結論

本研究采用酶解輔助提取了福建平和蜜柚皮多糖。以酶用量、液料比和浸提時間3 個因素為變量，以多糖得率為響應值，利用Box-Behnken 設計原理，成功建立了多糖得率的二次多項式模型。綜合考慮模型預測數據和試驗驗證結果，最終確定了酶解提取蜜柚皮多糖的最佳工藝條件：酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提時間2 h，在此條件下蜜柚皮多糖得率可達到（2.73±0.21）%。本研究獲得了福建平和蜜柚皮多糖，提高了柚皮的利用率，為果蔬的廢棄資源再利用提供參考依據，也為福建蜜柚皮多糖的開發研究提供理論基礎。