殼聚糖-纖維素納米纖維復合膜的制備及表征

陳曉霞，邱宇龍，李儀茜，畢景然

（大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

隨著人們生活水平的日益提高，食品質量和安全問題越來越受到消費者的廣泛關注。目前石油衍生聚合物在食品保鮮領域得到了廣泛的開發和應用，但由于其不可回收及不可生物降解性，消費者對天然生物聚合物材質的食品保鮮膜認同度更高[1-2]。

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然的陽離子多糖，具有良好的成膜性、生物降解性[3]、抗氧化性和抗菌活性[4]，因此，CS 基復合膜被廣泛應用在食品保鮮方面[5]。然而，由于CS 糖苷鏈上的分子內和分子間的網絡鏈間隙，導致CS 基復合膜機械性能較差，限制了CS 的實際利用[6]。纖維素是一種天然大分子多糖，由β-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，結晶度高，由纖維素I 晶型和無定形區組成。由氧化法制備的纖維素納米纖維（cellulose nanofibrils，CNF），在纖維素分子上引入了大量的羧基，具有高長徑比、高比表面積以及無定形晶體結構，能夠通過氫鍵建立牢固的納米纖維素網絡結構，可作為復合膜的增強填料[7]。Yadav等[8]采用共混法制備了CNF/CS 綠色復合薄膜，隨著CNF 添加量的增加，復合膜的吸濕率和水溶性都呈現下降趨勢，可作為食品包裝用于食品保鮮。Tang 等[9]以CNF為增強填料，制備了可降解、透明度高的CS/瓜爾膠（guar gum，GG）/CNF 納米復合膜，與純CS/GG 膜相比，CS/GG/CNF 納米復合膜的抗拉強度更大，氧氣透過率更低，是一種潛在的新型食品包裝材料。京尼平（genipin，GP） 是梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解后的產物，化學結構具有羥基、羧基等多個活性基團，其毒性與人工合成的化學交聯劑相比較小[10]。京尼平作為京尼平苷的苷元衍生物，可用于多種天然生物材料的交聯，是一種優良的天然生物交聯劑，可以與CS 分子上的伯氨基反應生成雜環胺，引發CS 分子通過短橋結構進行有序的交聯[11]。通過GP 交聯形成的大分子網絡結構，交聯程度高、性質穩定、阻隔性能強。

本研究以絲瓜絡為原料，通過2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）氧化法制備CNF。以GP 作為交聯劑，通過在CS 中添加不同量的CNF，制備CS-GP-CNF 復合膜，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）及X 射線衍射（X-ray diffractometer，XRD）等技術對復合膜的結構進行表征，探究復合膜的交聯機制，并研究不同添加量的CNF 對復合膜水蒸氣透過率的影響，探討CS-GP-CNF 復合膜在雞肉冷藏保鮮中的應用效果，以期為天然食品包裝膜的制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲瓜絡：天津品煜悠佳商貿有限公司；CS（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；GP（98%）、脂肪醇聚氧乙烯醚：上海麥克林生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、乙酸、鹽酸、氫氧化鉀、次氯酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；溴化鈉、TEMPO（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

中草藥粉碎機（FW177）：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：深圳市三莉科技有限公司；電熱鼓風干燥箱（GFL-70）：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；自動凱氏定氮儀（K9840）：山東海能科學儀器有限公司；透射電子顯微鏡（JEM-2100）、SEM（JSM-7800F）：日本電子株式會社；傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum II）：鉑金埃爾默儀器有限公司；X 射線衍射儀（XRD-7000S）：日本島津公司；真空冷凍干燥機（FD8-3）：美國Siemon 公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素的制備

將40 g 絲瓜絡用中草藥粉碎機粉碎，加入至10g/L的脂肪醇聚氧乙烯醚（質量濃度2%）滲透劑中，連續攪拌24 h 后，用去離子水徹底清洗樣品，之后采用乙酸乙酯萃取。在75 ℃下緩慢加入40 mL 乙酸和60 g 次氯酸鈉。過濾后的樣品在90 ℃下與400 mL 氫氧化鉀溶液（5%）混合攪拌2 h，去除半纖維素。在80 ℃下，利用400 mL 鹽酸（1%）攪拌剩余樣品2 h 后，用去離子水洗滌至中性，采用真空冷凍干燥機凍干得到纖維素粉。

1.3.2 CNF 的制備

將1 g 纖維素粉與100 mL TEMPO-NaBr 溶液（含0.1 g TEMPO 和0.016 g NaBr）混合，在30 ℃下攪拌4 h，攪拌過程中緩慢滴加0.5 mol/L NaOH 溶液，調節反應溶液至pH10。加入10 mL 無水乙醇終止反應，將反應后的產物用去離子水反復潤洗至中性，10 000 r/min 離心10 min，去除上層清液，將沉淀凍干即得CNF[12]。

1.3.3 CS-GP-CNF 復合膜的制備

將CS（1.5 g）溶于100 mL 1%乙酸溶液中，攪拌6 h，制得1.5% CS 溶液。隨后，將CNF 分別按CS 的0%、1%、2%、3%、6%（質量分數） 加入到CS 溶液中。攪拌20 min 后，加入終濃度為0.15 mmol/L 的GP 水溶液，攪拌30 min，制備CS-GP-CNF 交聯溶液。超聲1 h 后，將200 mL CS-GP-CNF 交聯溶液倒入模具（30 cm×25 cm）中，在40 ℃下干燥2 h，形成干燥的復合膜，樣品分別記為CS-GP-CS、CS-GP-CNF1、CS-GP-CNF2、CS-GPCNF3、CS-GP-CNF6。

1.3.4 測試與表征

1.3.4.1 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察

將一滴用去離子水稀釋的CNF 懸浮液滴在有碳涂層的銅網上，然后用乙酸雙氧鈾復染2 min，并在室溫下晾干。使用TEM 觀察CNF 形貌。

1.3.4.2 FTIR 分析

使用溴化鉀壓片后對CNF 進行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1；對CS-GP-CNF 復合膜進行掃描，掃描范圍為4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.4.3 XRD 分析

XRD 譜圖掃描范圍為5°～60°，掃描速度為5°/min。結晶度計算公式如下。

Cr=（I002-Iam）/Iam

式中：Cr為結晶度，%；I002為（002）面衍射的最大強度；Iam為樣品非晶態部分散射的強度。

1.3.4.4 SEM 觀察

將CS-GP-CNF 復合膜用液氮冷凍后脆斷，噴金，利用SEM 對復合膜的橫切面進行微觀形貌分析。

1.3.4.5 水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）測定

采用WVP 測試系統對樣品進行水蒸氣透過率的測試[13]。將CS-GP-CNF 復合膜剪成直徑60 mm 的圓形，固定在裝有20 mL 飽和NaCl 溶液的稱量瓶（相對濕度為75%）的頂部，然后放置在裝有CaCl2的干燥器（相對濕度0%）內。每隔24 h 定期對試驗容器進行稱重，連續稱量3 d。水蒸氣透過率計算公式如下。

W=（△m×x）/（A×△t×△P）

式中：W為水蒸氣透過率，g/（s·m·Pa）；△m 為試驗前后的質量差，g；x為復合膜的平均厚度，m；A 為復合膜面積，m2；△t 為測量時間差，s；△P 為復合膜兩側的水蒸氣壓差，2 809 Pa。

1.3.5 CS-GP-CNF6在雞肉貯藏中的應用

為評價復合膜的實際應用價值，以CS-GP-CNF6復合膜為包裝材料對雞肉進行保鮮。將雞胸肉在120 ℃的高溫下油炸2 min，然后轉移至沸水中煮15 min，以模擬燒雞加工工藝。將雞肉切成2 cm×2 cm×2 cm 的小塊，用制備好的復合膜包覆雞肉，試驗組分別為CS-GPCNF6、商用聚乙烯保鮮膜和未包膜空白組。將包覆好的雞肉放于4 ℃冰箱冷藏，分別貯藏1、3、5、7、10 d 后測定樣品的菌落總數和揮發性鹽基氮含量。

1）菌落總數測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行雞肉中菌落總數的測定[14]。

2）揮發性鹽基氮含量的測定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》進行雞肉中揮發性鹽基氮含量的測定[15]。

1.4 數據分析

利用Excel 2010 軟件對試驗數據進行整理與分析，使用Origin 2021 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 CNF 的性質

2.1.1 TEM 分析

CNF 的TEM 圖像見圖1。

圖1 CNF 的TEM 圖像Fig.1 TEM images of CNF

從圖1 中可以發現CNF 的平均寬度為（7.3±3.6）nm，平均長度為（156.3±46.9）nm。CNF 長徑比可高達21.41，因此，可作為復合膜的增強填料，以提高其阻隔性能。另外，纖維素粉經過TEMPO 催化處理后，CNF之間存在團聚現象，這是由于氧化作用導致纖維素分子中大部分—OH 和—COOH 等親水性基團暴露，在分子內及分子間形成大量氫鍵，引發團聚[16]。

2.1.2 FTIR 分析

CNF 的FTIR 圖像見圖2。

圖2 CNF 的FTIR 譜圖Fig.2 FTIR spectrum of CNF

由圖2 可知，在3 361～3 343 cm-1處出現較強較寬的吸收峰，這是由—OH 伸縮振動產生的纖維素的特征峰。在2 910 cm-1處存在的尖峰對應為C—H 的伸縮振動吸收峰，在1 649 cm-1處的特征峰是酰胺基Ⅰ的彎曲振動，1 200 ～1 000 cm-1吸收帶屬于—C—O—的伸縮振動峰，890 cm-1處對應的是纖維素C—H 的變形振動[17]。木質素對應的芳香骨架振動峰（1 510 cm-1）、C—H 伸縮振動峰（1 246 cm-1）和彎曲振動峰（828 cm-1）在CNF 圖譜中沒有顯示，說明原料中的木質素已完全通過TEMPO 氧化被去除。

2.1.3 XRD 分析

通過氧化反應制備的CNF 的XRD 結果見圖3。

圖3 CNF 的XRD 譜圖Fig.3 XRD spectrum of CNF

由圖3 可知，CNF 在2θ=15.8°、22.4°和34.42°附近處出現明顯的衍射峰，分別代表了纖維素I 型結晶結構的（110）、（012）以及（040）晶面。計算得到CNF 的結晶度為72.3%，這說明TEMPO 氧化可能只發生在纖維素的無定形區，對內部晶區影響不大，因此纖維素的晶型結構得以保持。

2.2 復合膜的性質

2.2.1 SEM 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的橫切面形貌見圖4。

圖4 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的橫切面形貌Fig.4 Cross-section images of CS-GP-CS and CS-GP-CNF composite films

由圖4 可知，在化學交聯劑京尼平的作用下，CS可以充分交聯，形成結構完整，表面均一、光滑、無氣泡的CS-GP-CS 復合膜。Costa 等[18]的研究表明，隨著CNF 添加量的逐漸增大，京尼平分子中的酯基（C-11）逐漸被CNF 取代，產生了高分子量的酸酐基團，并通過氫鍵作用形成了結節狀網絡結構，由此造成復合膜表面形貌的粗糙節點，其中CS-GP-CNF6復合膜的橫切面形貌明顯出現小型白色團聚結構。

2.2.2 FTIR 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的FTIR 譜圖見圖5。

如圖5 所示，CS-GP-CS 復合膜的FTIR 譜圖中，在3 434 cm-1和2 854 cm-1處存在CS 分子中O-H 和C-H 基團的伸縮振動典型吸收峰。由于CS 的氨基與京尼平C-3 處的烯烴碳原子發生了親核取代反應，因此，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復合膜在1 452 cm-1處均存在與C-N 的伸縮振動相關的吸收峰。同時，GP 分子C-11 上的酯基分別被CS 和CNF 取代，分別對應仲酰胺（1 637 cm-1）和酸酐（1 459 cm-1）的吸收峰，證明CSGP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜中存在化學交聯作用。

2.2.3 晶體結構

CNF、CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的XRD譜圖見圖6。

如圖6 所示，CS-GP-CS 復合膜的XRD 譜圖在2θ=8.18°、11.68°、18.26°處存在3 個衍射峰，在23.54°處有一個寬峰，這是典型的半晶指紋圖譜。當CNF 通過GP 與CS 交聯時，CNF 分子中的羧基被交聯劑取代。因此，交聯網絡體系中分子間和分子內氫鍵的分布發生了部分改變，但其規律性并未被明顯破壞。此外，由于CNF 的典型纖維素I 結構的晶體平面與CS的衍射峰重疊，因此，CS-GP-CNF 復合膜的XRD 譜圖形狀與CS-GP-CS 相似。隨著CNF 添加量的逐漸增大，2θ=11.68°處的衍射峰逐漸增大，說明CS-GP-CNF復合膜的面間距離變小。

2.2.4 WVP 測定結果

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的水蒸氣透過率見表1。

表1 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的水蒸氣透過率Table 1 Water vapor permeability of CS-GP-CS and CS-GPCNF films

阻隔性能是食品包裝材料防止食品腐敗的重要指標，特別是優良的阻水特性可有效避免微生物繁殖。水蒸氣透過率可反映包裝食品與周圍大氣之間的水分交換速率。如表1 所示，由于化學交聯劑GP 的作用，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復合膜的交聯結構緊密，均展現出較高的防潮性能。雖然CNF 表面親水位點豐富，具有較高的親水性，但CS-GP-CNF 復合膜的WVP 仍較低，如CNF 含量最高的CS-GP-CNF6復合膜的WVP 為1.14×10-11g/（s·m·Pa），遠低于玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合膜[4.62×10-6g/（s·m·Pa）][19]。

2.2.5 CS-GP-CNF 復合膜在雞肉貯藏中的應用

2.2.5.1 菌落總數

不同包裝材料對冷藏雞肉菌落總數的影響見圖7。

圖7 不同包裝材料對冷藏雞肉菌落總數的影響Fig.7 Effect of different films on colony number of chicken during refrigerated storage

如圖7 所示，在4 ℃條件下，隨著貯藏時間的延長，各組雞肉的菌落總數不斷增加，其中，未包膜空白組雞肉的菌落總數上升速率最大，在貯藏第3 天達到（4.49±0.14）lg（CFU/mL），超過了GB/T 20558—2006《地理標志產品符離集燒雞》[20]中規定的菌落總數限值4.47 lg（CFU/mL）。商用聚乙烯保鮮膜雖對雞肉具有保護作用，但在第10 天時，雞肉的菌落總數達到了（5.10±0.21）lg（CFU/mL）。由于CS 良好的抑菌性[21]及復合膜的防潮特性，在貯藏第10 天時，被CS-GPCNF6復合膜包覆的雞肉菌落總數仍未超過標準限值，僅為（4.16±0.09）lg（CFU/mL），表明CS-GP-CNF6復合膜可以有效地抑制雞肉的細菌生長。

2.2.5.2 雞肉的揮發性鹽基氮含量

揮發性鹽基氮是判斷肉制品新鮮度的重要指標之一。在內源酶和微生物的作用下，蛋白質會被降解成小分子氨和胺類，可通過凱氏定氮法測定揮發性鹽基氮含量。不同包裝材料對冷藏雞肉揮發性鹽基氮含量的影響見圖8。

由圖8 可知，新鮮雞肉的初始揮發性鹽基氮含量為（10.0±0.5）mg/100 g，各組的揮發性鹽基氮含量變化趨勢基本一致，均隨著貯藏時間的延長而升高。參照肉制品新鮮度判定標準：揮發性鹽基氮含量一級鮮度≤15.00 mg/100 g，二級鮮度≤25.00 mg/100 g[21]。未包膜空白組雞肉的揮發性鹽基氮含量在貯藏1 d 后達到18.70 mg/100 g，由一級鮮度轉為二級鮮度，且在第7天超過25.00 mg/100 g。商用聚乙烯保鮮膜包裹的雞肉樣品于貯藏第3 天轉為二級鮮度，貯藏第7 天時揮發性鹽基氮含量為25.31 mg/100 g。相比之下，CS-GPCNF6復合膜包覆雞肉的揮發性鹽基氮含量整體低于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。CS-GP-CNF6組雞肉的揮發性鹽基氮含量在貯藏第5 天時僅為16.20 mg/100 g，且可保障雞肉的二級鮮度直至第10天（此時雞肉揮發性鹽基氮含量為21.20 mg/100 g），表明CS-GP-CNF 復合膜具有潛在的食品保鮮能力。

3 結論

本文以絲瓜絡為原料制備了長徑比為21.41 的CNF，并以CNF 及天然多糖聚合物CS 為原料，通過GP 化學交聯，制備了表面均一、光滑、無氣泡的CSGP-CNF 復合膜。當CNF 添加量為CS 質量的6%時，所制備的CS-GP-CNF6復合膜的水蒸氣透過率僅為1.14 × 10-11g/（s·m·Pa）。以CS-GP-CNF6復合膜包覆雞肉樣品，評價其在食品保鮮領域的實際應用價值，結果顯示，在4 ℃下貯藏10 d 時，雞肉的菌落總數和揮發性鹽基氮含量分別為（4.16±0.09）lg（CFU/mL）和21.20 mg/100 g，保鮮效果明顯優于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。