基于網絡藥理學探討加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的潛在靶點及作用機制

葉潤杰， 黃培紅

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006；2.廣東省第二中醫院，廣東廣州 510095）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種原因導致心臟結構和（或）功能異常改變，使心室收縮和（或）舒張功能發生障礙，從而引起的一系列復雜臨床癥狀，主要表現為呼吸困難、疲乏和液體潴留（肺淤血、體循環淤血及外周水腫）等[1]。中醫學方面，2009年國家中醫藥管理局將慢性心力衰竭的中醫病名統一為“心衰病”。溫陽益氣、活血利水是治療慢性心力衰竭的基本大法[2]。加味參附顆粒是廣東省第二中醫院的院內中藥復方制劑，由紅參、熟附子、茯苓、三七、麥冬、葶藶子組成，具有益氣溫陽、活血利水之功效，臨床研究證實，其可增強慢性心力衰竭患者心肌收縮力、增加心排血量、降低體循環外周阻力、改善心臟重構和調節神經內分泌，可有效改善心功能、降低再次住院率、提高生存率和生活質量[3-6]；但本方的作用機制尚不完全清楚。網絡藥理學作為一門新興學科，融合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科技術，能將生物學網絡與藥物作用網絡整合，探究藥物和疾病相互作用的原理，目前被廣泛用于闡釋疾病機制及中藥作用機制。本研究運用網絡藥理學手段，結合文獻調研、數據挖掘、生物信息學等方法，構建加味參附顆粒與慢性心衰相互作用的關系網絡，發掘加味參附顆粒的作用靶點及藥物與靶點、生物通路的相互作用關系，從而預測和推斷出其有效藥物成分的作用靶點及其調控的生物學機制，力求更全面深入地揭示加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 加味參附顆粒有效成分的篩選與作用靶點的獲取通過TCMSP 平臺（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）搜索加味參附顆粒組成中藥紅參、附子、茯苓、葶藶子、三七的成分，設置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，得到有效成分后通過其MOL.ID 號搜尋單味藥成分的作用靶點。加味參附顆粒中藥物組成麥冬的成分及其靶標則利用中藥分子機制的生物信息學分析工具BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）在線預測，在“Formular（Pinyin Name）”輸入關鍵詞“MAI DONG”，并選擇其中可信度高的蛋白作為靶點（Score cutoff=20，校正P值0.05），得到麥冬成分中活性化合物及作用靶點。并將以上結果輸入UniPort（www.uniport.org）數據庫，對靶點名稱進行規范。

1. 2 慢性心力衰竭疾病相關靶點預測以及韋恩（Venn）圖建立運用GeneCards（www.genecards.org）、Disgnent（www.disgenet.org）平臺獲取疾病相關靶點，“chronic heart failure”為關鍵詞預測慢性心力衰竭相關靶點。利用Venny分析工具將疾病靶點與加味參附顆粒藥物靶點進行對比分析，繪制Venn圖。

1.3 藥物-成分-靶點網絡的構建為了更加清晰地展示藥物、成分、靶點之間的關系，運用Cytoscape 3.9.1 軟件，構建藥物-成分-靶點網絡，結合靶點度（degree）值對該網絡進行可視化分析。

1. 4 加味參附顆粒與慢性心力衰竭蛋白互作（PPI）全局網絡的構建將加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的潛在靶點導入STRING 數據庫，進行PPI分析，物種設置為“Homo sapiens（人）”，最高相互作用評分設置為“Highest Confidence（最高等置信度）”0.900，其余參數保持默認設置，獲取相互作用關系。將信息導出并利用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制PPI網絡，對該網絡進行數據分析，根據度值分析關鍵靶蛋白。

1.5 GO和KEGG富集分析為了研究加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的通路信息和生物過程、分子功能、細胞組分信息，運用Metascape（http://metascape.org/）數據庫對交集靶點進行分析。設置P值Cutoff 值為0.01，根據富集程度選取前20 條目，利用微生信平臺（www.bioinformatic.com.cn）制作氣泡圖，對結果進行可視化分析。

1.6 構建成分-靶點-通路網絡根據KEGG 富集分析結果，按照LogP值選取前20條，再根據富集通路涉及的核心靶點以及靶點對應的成分，運用Cytoscape 3.9.1 軟件構建成分-靶點-通路網絡圖，并對網絡圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 加味參附顆粒的有效成分及作用靶點的獲取結果根據TCMSP 數據庫的OB 和DL 值以及BATMAN-TCM 數據庫高可信度，剔除重復化合物和缺少靶點數據預測的化合物，得出加味參附顆粒中有效活性化合物49 個，其中，紅參3 個、附子6 個、茯苓6 個、葶藶子9 個、三七7 個、麥冬18 個，再去除共同成分后，總有效活性成分共有42個。結合UniPort數據庫的確認并轉換，共獲取靶點435個。化合物及靶點信息見表1。

表1 加味參附顆粒的活性成分及靶點信息Table 1 Information of active components and targets of Modified Shenfu Granules

2.2 慢性心力衰竭與加味參附顆粒交集靶點的獲取結果運用GeneCards 和Disgnent 平臺獲取慢性心力衰竭的相關靶點共223 個，將“2.1”項中藥物靶點與疾病靶點輸入微生信在線繪制Venn圖平臺進行映射，共得出38 個藥物-疾病交集靶點。見圖1。

圖1 加味參附顆粒與慢性心力衰竭靶點基因Venn圖Figure 1 Venn diagram of Modified Shenfu Granules and chronic heart failure target genes

（續表1）

2. 3 藥物-成分-靶點網絡的構建結果使用Cytoscape 3.9.1 軟件構建藥物-成分-靶點網絡圖（見圖2）。該網絡圖共有節點483 個（藥物節點6 個，有效成分節點42 個，靶點節點435 個），1 042 條邊。淡紫色代表藥物，天藍色代表靶點，其他顏色則代表各藥物的有效成分。該網絡中，“邊”代表兩者之間的相互作用關系，邊越多代表一個節點與其他節點的相互作用關系越大，則該節點的度值越高，表示該節點在疾病治療過程中越關鍵。圖2結果顯示，度值較高的有效活性成分為槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、尿苷（uridine）、異鼠李素（isorhamnetin）、鳥苷（guanosine）、麥冬甲基黃烷酮B（methyl ophiopogonanone B）、麥冬黃烷酮E（ophiopogonanone E）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等。

2.4 PPI 網絡構建結果將加味參附顆粒與慢性心力衰竭靶點的交集蛋白導入STRING 中構建PPI網絡。得到TSV 文件后導入Cytoscape 3.9.1 進行可視化分析，見圖3。圖中有25 個節點，98 條邊。“節點”代表交集蛋白，“邊”代表蛋白間的關聯作用；圖形越大、顏色越深，則代表度值越大。圖中節點的平均度值為7.84，中心度（CC）平均值為0.488，介數（BC）平均值為0.058。其中，度值較高的核心靶點分別為白細胞介素6（IL-6）、轉錄因子P65（RELA）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、細胞腫瘤抗原P53（TP53）、內皮素1（EDN1）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9。

2.5 GO 富集分析結果使用Metascape 數據庫對PPI中核心靶點進行GO功能富集分析，得到1 010個生物過程，41 個細胞組分以及39 個分子功能，分別對前20個功能繪制氣泡圖（見圖4）。從圖4-A可以看出，核心靶點主要涉及血液循環、細胞群增殖的負向調節、平滑肌細胞增殖的調節、缺氧的反應、血壓的負調節、對無機物的反應、細胞遷移的正向調節、細胞分泌的調節、對創傷的反應等生物過程。從圖4-B 可看出，核心靶點在突觸前膜、膜筏、血小板α顆粒管腔、谷氨酸能突觸等均有分布。從圖4-C 可看出，核心靶點主要具有蛋白質同源二聚化活性、受體配體活性、G蛋白偶聯腺苷受體活性、腎上腺素受體活性、蛋白質異二聚化活性、蛋白質結構域特異性結合、黃素腺嘌呤二核苷酸結合等分子功能。

2.6 KEGG通路分析結果使用Metascape 數據庫對PPI網絡中核心靶點進行KEGG通路分析，得到112 條通路（P＜0.05），按照logP值進行排序，選擇前20 條通路進行氣泡圖展示，見圖4-D。由圖可見：“豎軸”代表通路（pathway），“橫軸”代表富集因子（rich factor）；圖中氣泡面積越大，代表通路涉及基因數越多；氣泡越紅，代表富集顯性越強。根據KEGG通路分析結果，提示加味參附顆粒對慢性心力衰竭起主要治療作用的通路包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、癌癥通路、HIF-1信號通路、脂質和動脈硬化途徑、松弛素信號通路、鈣信號通路、內分泌抵抗通路、乙型肝炎通路、恰加斯病通路、結核病通路、鞘磷脂信號通路、胰腺癌通路、IL-17信號通路、阿米巴病通路、TNF信號通路、弓形蟲病通路、MAPK 信號通路、癌癥中的蛋白聚糖通路、cAMP信號通路等。

2.7 成分-靶點-通路網絡構建結果為了更加清晰地展現加味參附顆粒的藥物成分、疾病靶點和通路的關系，構建成分-靶點-通路網絡圖（見圖5）。該網絡共有節點85個，其中，藥物節點6個，有效活性成分節點19個，靶點節點39個，通路節點一共20個，疾病節點1個，共有359條邊。該網絡圖中，度值較高的通路有剪切應力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路、鈣信號通路、IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、cAMP 信號通路。度值比較高的靶點節點有RELA、 TNF、 MAPK8、 BAX、TGFB1、 BCL2、 NOS3、 IFNG、 IL6、 ADRB2、MMP9、TP53、VEGFA、NOS2 等。度值較高的活性成分分別是槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚等。

圖5 加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的成分-靶點-通路網絡圖Figure 5 Network diagram of components-targets-pathways for the treatment of chronic heart failure with Modified Shenfu Granules

3 討論

慢性心力衰竭的中醫病名為“心衰病”。中醫學認為，久病遷延不愈，心陽虧虛，心主血脈功能減退，致使血脈瘀阻，母病及子，脾氣不足，不能運化水液，水濕內停；心病乘肺，不能通調水道，上焦之水不能下輸膀胱，停于心下；病情進一步發展，心病侮腎，使腎陽虧虛，腎水泛濫：氣、血、水郁積于體內，最終致心衰發生，表現出氣促、乏力等一系列臨床癥狀。陽氣虧虛、血瘀水停貫穿心力衰竭始終。加味參附顆粒作為我院的院內制劑，在臨床上可明顯改善慢性心力衰竭患者的心功能指標，提高患者的生活質量，改善臨床癥狀。方中：紅參味甘、苦而性溫，為補五臟陽氣之要藥，附子大辛大熱，能上溫心陽，下補命門，內溫脾土，外固衛陽，二者共用，能補益心氣、振奮心陽以治本，共為君藥；三七味甘、微苦，性溫，具有化瘀止血、活血的作用，化瘀血而不傷新血，為理血之妙藥，茯苓味甘、淡而性平，具有利水滲濕、健脾和中、寧心安神之效，兩者共奏疏通經絡、活血利水之功，共為臣藥；葶藶子味苦、辛而性寒，具有瀉肺平喘、利水消腫之效，使水飲有出路，破滯氣而定喘，瀉停水而寧嗽，麥冬味甘性寒，有滋陰養心之效，且可制約上藥的溫燥，又可引諸藥入心經，兩者共為佐、使藥。諸藥合用，共奏溫陽益氣、活血利水之效。

本課題組前期研究表明：加味參附顆粒可以提高慢性心力衰竭大鼠心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP 酶的活性，下調血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 等的水平，減輕心肌細胞的損傷，抑制心臟重構[7]；加味參附顆粒還可調節神經內分泌系統，通過抑制慢性心力衰竭時被過度激活的腎素-血管緊張素系統，使去甲腎上腺素、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的釋放明顯下降，從而減少對心肌細胞的損傷和凋亡[6]。加味參附顆粒可增加超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具有一定的抗氧化作用，可保護動脈血管內皮細胞，減少膿毒癥心肌損傷[8]。在此基礎上，本課題組進一步通過網絡藥理學深入探討加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的作用機制。

本研究結果顯示，加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、常春藤皂苷元、尿苷、異鼠李素、麥冬甲基黃烷酮B、麥冬黃烷酮E、人參皂苷Rh2 等。大量研究表明，黃酮類物質包括槲皮素、山柰酚、異鼠李素等在內，對于心血管疾病具有良好的藥用價值。槲皮素在心血管疾病中的療效突出[9]，其可通過抑制AngⅡ誘導的成纖維細胞的增殖和分化，減少心肌細胞纖維化和肥大，進而抑制心臟重構以及改善心功能。山柰酚同樣具有抗心肌細胞肥大及纖維化的作用，還可抗心肌細胞凋亡[10]。異鼠李素具有抗動脈粥樣硬化、抗血栓、抗高血壓、降血脂以及抑制心肌肥厚等廣泛藥理作用[11]。亦有大量研究表明，豆甾醇和β-谷甾醇對心臟病、高血壓、高膽固醇血癥等疾病具有良好的治療作用。豆甾醇具有較強的抗氧化作用，可增加SOD的活性[12]，同時，可抑制腸道對膽固醇的吸收并抑制肝臟膽固醇的合成[13]；β-谷甾醇具有預防動脈粥樣硬化的作用，能夠進一步降低心血管疾病的發生風險[14]。常春藤皂苷元可通過抑制IKKβ/NF-κB信號通路抑制炎癥反應，進而改善冠狀動脈血液流變學，調節血管內皮功能[15]。尿苷能夠提高細胞的抗氧化能力以及調節細胞線粒體，減少因線粒體損傷導致的細胞凋亡，在細胞生長和代謝的過程中發揮重要作用[16]。人參皂苷Rh2 可通過提高血清血管內皮生長因子（VEGF）水平，誘導外周血內皮祖細胞（EPCS）向成熟內皮分化，促進血管內皮細胞的增殖和血管的形成，進而改善心肌供血，另外，還可以提高血清和心肌組織抗氧化酶活性，清除心肌組織內的氧自由基，降低其炎癥以及體內應激反應[17]。黃烷酮類成分，如麥冬黃烷酮E和麥冬甲基黃烷酮B，具有良好的細胞保護和清除氧自由基的作用[18]，麥冬甲基黃烷酮B 可通過NADHP 途徑抑制P22phox 蛋白的過度表達，增加SOD 的活性，降低丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平，從而發揮抗氧化作用，保護心肌細胞及血管內皮細胞[19]。

從PPI網絡構建結果可知，加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的核心靶點有IL-6、RELA、TNF、VEGFA、MMP-2、MAPK8、TP53、EDN1、MMP-9等。IL-6、TNF 是心力衰竭后上升的炎癥反應因子，對心臟具有保護作用，但長期的高表達狀態會抑制心肌收縮力、誘導心肌細胞肥大和纖維化，促進心肌細胞的凋亡[20]。RELA 參與心肌細胞炎癥反應、心肌細胞代謝及心室重構等過程[21]。VEGFA 既是血管通透性因子，也是促血管生成因子，研究表明，VEGFA 能夠促進心臟血管生成，改善心肌肥厚導致的心肌缺血狀況，從而對心臟起保護作用，改善心功能，減緩心肌收縮力的下降和心肌肥厚[22-23]。基質金屬蛋白酶（MMPs）是在細胞外基質分解過程中起關鍵作用的一種內肽酶，其功能異常會導致心臟收縮或舒張功能障礙[24]。MMP-2、MMP-9為MMPs的2種亞型，均是心臟重構和慢性心力衰竭發展中重要的酶[25]。MMP-2與心臟纖維化程度密切相關，MMP-9則能調控心臟纖維程度與炎癥反應過程，可打破心肌細胞降解及重塑的平衡，導致心肌膠原重構[25-26]；此外，MMP-2、MMP-9 可促進動脈粥樣硬化和斑塊破裂[27]，容易誘發急性心肌梗死，加重心力衰竭。MAPK8 參與心肌細胞的增殖、代謝和凋亡的過程[28]。TP53 主要有誘導細胞周期阻滯和抑制血管生成的作用，參與心肌細胞的糖酵解和凋亡調控因子（TIGAR）的調控；在心力衰竭中，TP53 會上調TIGAR 和抑制糖酵解，導致心肌能量和功能受損[29]。EDN1 的表達物質具有強烈持久縮血管和促進平滑肌細胞增殖的作用，可參與心室肌細胞肥厚、心臟重構，誘導心衰的發生[30]。

GO 分析和KEGG 通路分析結果以及成分-靶點-通路網絡構建結果提示，加味參附顆粒治療慢性心力衰竭主要與流體剪切應力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路、鈣信號通路、IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、cAMP 信號通路等相關。研究表明，流體剪切應力的信號傳導是由細胞內多種信號通路協調反饋的復雜整合過程，其中涉及NF-κB信號通路、MAPK 信號通路、eNOS/NO 信號通路、Caveolin-1通路等，流體剪切應力的異常可以促進動脈粥樣硬化病變的形成[31]，在冠心病的發生發展中起重要作用。AGE-RAGE 信號通路可通過影響p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/JNK 信號通路促進人主動脈平滑肌細胞凋亡[32]。MAPK 通路中，MAPK是細胞表面向核內傳遞的重要信號，貫穿細胞分裂、分化、增殖、凋亡等一系列的生理過程，MAPK 通路可以通過影響p38、JNK、ERK 等通路，調控相關蛋白的表達，影響細胞凋亡[33]。HIF-1信號通路可上調與血管系統相關蛋白基因的表達，抑制機體炎癥反應、心肌細胞凋亡和血管平滑肌細胞鈣化，與心血管疾病的發生與發展密切相關[34-36]。鈣信號通路是心肌重構的重要通路，鈣離子（Ca2+）是胞漿內重要的第二信使，是蛋白激酶C（PKC）、MAPK 等通路的共同交匯點，這些通路共同參與心臟心肌重構[37]。IL-17 信號通路可影響機體炎癥反應，誘導成纖維細胞的激活，使心肌纖維化[38]。TNF信號通路具有雙向調節性，其既可促進也可抑制心肌細胞的凋亡[39]。cAMP 信號通路具有抑制炎癥反應和抑制動脈粥樣硬化的作用[40]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學，探討加味參附顆粒治療慢性心力衰竭的有效成分、作用途徑，并預測其潛在靶點，最終發現42 個有效活性成分，38 個核心靶點。根據GO、KEGG 分析的結果提示，加味參附顆粒主要通過IL-6、RELA、TNF、VEGFA、MMP-2、MAPK8、TP53、EDN1、MMP-9等核心靶點，調節流體剪切應力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路、鈣信號通路、IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、cAMP 信號通路，從而改善心臟供血，抑制炎癥反應，抗氧化激，抑制心肌重構，調節心肌細胞代謝，發揮治療慢性心力衰竭作用。后續有待利用動物實驗進一步驗證。