一種新型基于羅丹明B選擇性檢測食品中鉻離子的熒光探針的研究*

賴麗清，范曉慧，黃鷺強，李達諒*

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.建甌市東游鎮人民政府，福建 南平 353000）

鉻（Cr）是人體生長發育所必需的微量元素之一，但過高水平的鉻（Ⅲ）離子會影響機體內的酶活性，破壞細胞結構，導致氧化還原失衡，影響體內抗氧化系統的平衡，損害皮膚、肝、腸、呼吸系統等，導致皮膚出現紅斑、潰瘍、水腫等癥狀，引起鼻黏膜腫脹、頭痛、呼吸氣短、嗅覺減退、鼻出血等危害[1-3]。有研究表明，若長期大量攝入鉻（Ⅲ），人體患高血壓、肺癌、食管癌、糖尿病等疾病的可能性增加[4-6]。近十幾年來，隨著現代經濟的快速發展，特別是工業生活三廢的過量排放、含金屬農藥肥料的隨意濫用和含金屬常見日用品的不當處理，導致了重金屬被大量排放到土壤和地表水中，嚴重污染環境[7,8]。環境中的重金屬很容易以離子形式通過生物鏈在水產品、農作物等食品中積累，通過食物鏈被人體吸收，在生物體內積累，威脅著人們的身體健康[9,10]。因此，便捷、快速、高效、準確地對重金屬鉻離子實施監測對提高食品安全和保障人體健康具有重大意義。

目前，已有多種檢測技術用于鉻的檢測，如電感耦合等離子體質譜法[11]、石墨爐原子吸收光譜法[12,13]、伏安法[14,15]、高效液相色譜法[16]等，但這些方法大多存在儀器成本高、操作復雜、檢測時間較長等問題，限制其實現快速、實時檢測[17,18]。近年來，小分子熒光探針法因操作簡單、靈敏度高、檢出限低、選擇性好、響應時間快、不需參考溶液、便捷的可視化等優點而引起人們的廣泛關注[19]。其主要原理是基于探針分子選擇性識別目標分子后與其結合，并在一定的波長范圍內引起熒光光譜發生變化，而這種變化常常伴隨著濃度依賴性。利用這一特性，可達到定性與定量檢測目標分子的目的。目前越來越多可特異性識別目標分子的熒光探針被設計開發出來，并廣泛應用于食品行業[20,21]。

羅丹明螺內酰胺或螺內酯衍生物是非熒光且無色，而相應螺內酰胺/內酯的開環產生強烈的熒光發射和顏色變化，是制備熒光增強型探針的良好選擇，也是目前為止研究最多的一類熒光探針[22,23]，但較少數探針可特異性識別Cr3+。因此，本研究基于羅丹明B結構設計合成了一種新型選擇性識別鉻（Ⅲ）離子的熒光探針（FS-Cr），并通過結構表征和光譜特性表征對探針的傳感性質展開了研究。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

羅丹明B，購于安耐吉化學試劑公司；噻吩-2,5-二甲醛，購于畢得化學試劑公司；85%水合聯氨、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氘代氯仿、二甲亞砜、乙腈、六水合三氯化鉻、四水合氯化亞鐵、氯化鈷、氯化鉛、氯化鋅、氯化鋁、氯化鈣、硫酸鎘、碳酸銫、五水合硫酸銅、氯化汞、氯化鉀、氫氧化鋰一水化合物、氯化鎂、氯化錳、氯化鈉、氯化銨、氯化鎳、氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、69%的硝酸、30%過氧化氫，均購于國藥集團化學試劑有限公司；紫菜、海苔，市售實際樣品。

核磁共振波譜儀，美國布魯克公司；LCQ-FLEET質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；UV-1900雙光束紫外可見分光光度計，日本島津公司；FS5熒光分光光譜儀，愛丁堡儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 探針FS-Cr的合成

在25 mL 的圓底燒瓶中依次加入羅丹明B（888.48 mg，2.00 mmol）、水合聯氨（640.80 mg，20 mmol）、無水乙醇（200 mL）中，將混合物置于90 ℃下加熱回流攪拌過夜。薄層層析（TLC）檢測反應進程，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（體積比）。反應結束后，減壓旋蒸去除溶劑，化合物1粗產物由硅膠柱層析色譜分離純化，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯= 2∶1（體積比），得到灰色化合物1，產量為415.88 mg，產率為45.60%。

在25 mL的圓底燒瓶中依次加入化合物1（228 mg,0.50 mmol）、噻吩-2,5-二甲醛（70 mg,0.50 mmol）、無水乙醇（10 mL），將混合物置于90 ℃下加熱回流攪拌過夜。薄層層析（TLC）檢測反應進程，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（體積比）。反應結束后，減壓旋蒸去除溶劑，探針粗產物由硅膠柱層析色譜分離純化，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=7∶1（體積比），得到黃色化合物即為探針，產量為333 mg，產率為57.5%。合成路線見圖1。

圖1 探針的合成路線

1H NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.24(s,1H),7.97(s,1H),7.53(d,J=33.8 Hz,3H),7.20-7.07(m,2H),6.70-6.09(m,6H),3.33(s,8H),1.15(s,12H)；13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ 183.26,165.03,149.03,143.79,141.42,136.19,133.76,129.01,128.65,128.02, 124.36,123.50,107.84,106.04,98.06,44.42,12.71.MS(EI)，m/z:C34H34N4O3S 計算值578.24，實測值578。

1.2.2 溶液的制備

⑴ 探針工作液的制備

精確稱取一定量的探針粉末，溶于二甲亞砜溶液中，配置成濃度為10 mmol/L的探針工作液。

⑵ 不同分析物溶液的制備

精確稱取一定量的不同分析物六水合三氯化鉻、四水合氯化亞鐵、氯化鈷、氯化鉛、氯化鋅、氯化鋁、氯化鈣、硫酸鎘、碳酸銫、五水合硫酸銅、氯化汞、氯化鉀、氫氧化鋰一水合物、氯化鎂、氯化錳、氯化鈉、氯化銨、氯化鎳、氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，溶于去離子水中，配制成濃度為100 mmol/L的分析物溶液。⑶ 樣品前處理

紫菜樣品編號為1，海苔樣品編號為2。使用去離子水仔細清洗樣品，在干凈燒杯中，分別準確稱取0.1 g樣品，依次加入5 mL 69%的硝酸溶液，2 mL 30%的過氧化氫溶液，超聲20 min，直到樣品消解完全。將消解液轉至50 mL容量瓶中，用去離子水定容，制成樣品檢測液備用。

1.3 探針傳感特性研究

1.3.1 選擇性分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、6 μL不同分析物溶液（100 mmol/L），充分混勻。用熒光分光光度計掃描，獲得熒光光譜，記錄熒光強度，熒光分光光度計的激發波長555 nm，狹縫寬度為2 nm。

1.3.2 反應時間分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L，充分混合，間隔2 min，采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強度。

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、6 μL六水合三氯化鉻溶液（100 mmol/L），充分混合，間隔2 min，采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強度。

1.3.3 反應濃度響應分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、不同濃度的六水合三氯化鉻溶液（0～200 μmol/L），充分混勻。采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強度。

1.4 實際樣品檢測及加標回收

1.4.1 實際樣品檢測

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、2 μL探樣品檢測液，充分混勻。采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強度。

1.4.2 加標回收

在1.4.1基礎上，再加入不同濃度的六水合三氯化鉻溶液（2、4 μmol/L），充分混勻，再次掃描獲得熒光光譜，記錄熒光強度，平行實驗3次。

1.5 數據分析

以Cr3+濃度為橫坐標，以紫外吸收值和熒光強度分別為縱坐標分析其線性關系，計算檢測限。根據國際理論化學和應用化學聯盟（IU-PAC）的規定[18]，檢測限公式為 LOD=3b/k，其中信噪比為3，b為25次平行測得的空白溶液的標準偏差，k為熒光強度變化曲線的斜率。采用Chem Draw 2020軟件繪制相應的分子結構。采用Origin 2021軟件記錄、分析、處理實驗數據并繪制相關圖像。

2 結果與討論

2.1 探針傳感特性研究

2.1.1 選擇性分析

通過測定探針對不同分析物（Cr3+，Zn2+，Fe2+，Pb2+，Cd2+，Hg2+，Co2+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Cs2+，K+，Na+，Li+，NH4+，Ni+，Al3+，F－，Br－，I－，HCO3－，CO32－，SO42－，HPO42－，H2PO4－）的熒光響應，探究其傳感特性。結果如圖2，在含有探針的乙腈溶液中只有在加入Cr3+后體系顏色從無色變為亮粉色，探針開啟強熒光，在555 nm激發波長下，熒光強度變化最大，在584 nm發射波長處熒光強度顯著增大了81904.30倍，而其他離子的加入，體系的熒光光譜變化非常小。所以，探針對Cr3+表現出非常高的選擇性熒光響應。

圖2 探針加入不同離子后的熒光光譜

2.1.2 反應時間響應

本研究還考察了響應時間對熒光探針的影響，結果如圖3，探針在乙腈溶液中隨著時間的遞增，在584 nm處的熒光強度沒有發生明顯變化，這表明探針能在乙腈溶液中穩定存在。而繼續加入Cr3+（200 mmol/L）離子后，在0～4 min內體系的熒光強度迅速減弱，之后基本沒有發生變化，這表明探針與Cr3+反應時間為6 min。基于此，展開后續實驗。

圖3 反應時間對探針識別 Cr3+ 的影響

2.1.3 反應濃度響應

靈敏度是熒光探針的另一重要指標，所以通過測定探針對不同濃度的Cr3+的熒光響應，探究其濃度響應特性。結果如圖4，隨著Cr3+濃度的增加，體系的熒光強度逐漸增大。由圖可知，在555 nm激發波長下，584 nm發射波長處的熒光強度呈現出濃度依賴性。在3～15 μmol/L范圍內584 nm處的熒光強度與Cr3+濃度呈現出良好的線性關系，回歸方程為，線性相關系數R2為0.995，通過計算檢測限（LOD）為0.059 μmol/L。探針對Cr3+的濃度響應在熒光光譜響應中表現良好，具有優異的應用前景。

圖4 探針在乙腈溶液中隨著Cr3+ 濃度增加熒光強度變化

圖5 探針在乙腈溶液中檢測樣品的熒光光譜

2.2 實際樣品檢測及加標回收

為探究探針實際應用情況，隨機購買市售2份水產制品（藻類）進行了測定。探針工作液加入樣品1后體系在584 nm發射波長處測得的熒光強度為22929.78。加入樣品2后體系在584 nm處測得的熒光強度為38469.70。通過標準曲線計算，樣品1中Cr3+濃度為222.15 μg/kg，樣品2中Cr3+濃度為359.18 μg/kg。采用加標回收的方法進一步探究熒光探針法準確性，結果如表1所示。方法回收率在101.32%～118.5%。表現良好，滿足分析要求。

3 結論

本研究基于羅丹明結構設計合成了一種新型可選擇性識別Cr3+的開啟型熒光探針。探針在乙腈溶液中只有識別Cr3+時，引起體系溶液由無色變為亮粉色，并開啟強烈熒光。通過研究探針的傳感特性成功構建了一種高效靈敏可檢測食品中Cr3+含量的熒光檢測方法。該方法線性范圍寬、檢測限低、檢測速度快，在實際樣品檢測中也表現良好，有望應用于市場監測。

樣品種類Cr3+加標量（μmol/L）樣品1樣品2 024024實際Cr3+含量（μmol/L）8.41±0.0094 10.63±0.0190 12.45±0.0014 8.44±0.0022 10.81±0.0118 12.53±0.0502加標回收率－111.21%101.32%－118.50%102.25%