雙水相萃取技術在生物制藥中的應用

張 璟，邢 娜，韓 楊

（1.齊魯醫藥學院，山東 淄博 255300；2.淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

0 引言

分離提純技術現已被廣泛應用于基因工程、蛋白質工程等高新生物技術當中，但這些高新生物技術對生化分離技術的要求也更為苛刻，尤其是操作步驟更為繁瑣、處理時間也更長，嚴重影響到生物技術的工業化發展進程。分析雙水相萃取技術的特征，就其溫和高效的分離提純過程，以及提純過程不會使物質失活破壞的特點，通過不斷完善該項技術的集成工藝，雙水相萃取技術的生物領域應用將更為廣泛。

1 雙水相萃取技術作用機理

1.1 作用機理

與水-有機萃取技術類似，雙水相萃取技術是利用待萃取物質在兩相間的選擇性適配，由于兩相性質不同，萃取物質進入兩相介質的表面性質、化學鍵的不同，也就導致兩相中賦存萃取物質的濃度發生了變化。通過分析萃取物質在兩相中的濃度比也就是分配系數值K，實現物質分離提純過程。雙水相萃取技術早在1995 年就進行了生物工程方面的應用，研究者通過雙水相技術研究聚乙二醇、葡聚糖的萃取分離過程，也研究了聚乙二醇與鹽系統的提純分離過程；經過近二十年的發展，雙水相萃取技術已形成兩類基本模型：一是利用熱力學作用原理發展出的晶格模型，通過聚合成相作用研究蛋白質等物質的分離提純；二是滲透維里模型，通過粒子能量功能，研究包括逆流層析、雙水相親和分離等方面的應用。

1.2 雙水相萃取分離特點

雙水相萃取技術通過利用兩相溶液的聚合，當兩相水溶液濃度含量過高時自然分離效果，實現有用物質的分離提純。該項技術最早發現于18 世紀90 年代在研究人員研究明膠、可溶淀粉兩種水溶液混合過程，通過將上述兩種溶液混合，得出一個渾濁不透明液體，隨后靜置發生分離，形成兩層液相溶液，也就是雙水相溶液。從雙水相溶液形成的特點來看，該體系形成的主要原因是利用了高聚物之間的不相容效果，也就是高濃度水相體系的阻礙作用，導致兩水相無法互相滲透，從而實現了兩相分離，因此兩水相體系需要一定的形成條件，包括溫度、溶質等，一般具備如下分離特點：

1）適應條件溫和。雙相水萃取技術兩相體系中大部分成分是水，因此在溶質混合過程中不會因有機溶劑的使用，對所需分離提純溶質產生破壞，甚至能起到一定的保護效果，也就更適用于生物活性物質的提純過程。

2）操作簡便。由于是兩水相的分離提取過程，兩相張力小，可直接于后續分離工序銜接，無需經過額外蒸餾處理等操作，常溫操作過程適用工具簡單，生物活性物質不會失活。

3）萃取量大，效率高。雙水相萃取技術回收率可達90%左右，同時兩相分離速率也很快，體系選取合適情況下，分離提純倍數可達到20 倍，回收率十分可觀。

基于以上分離特點，雙水相萃取技術的作用機理主要是兩相溶質憎水程度存在不同時，就會分離出兩水相體系，出現相分離效果，同時憎水性差異越大，分離速率越快或分離越容易。通過分析一般性有機萃取方法與雙水相萃取技術進行對比，可以很容易看出雙水相體系中兩相密度以及折射率通常較小，這也就導致兩相水溶液的張力較小，一般有機萃取體系中水溶液界面張力可達1×10-3～2×10-2N/m，而對于雙水相萃取體系的界面張力通常只有10-6～10-4N/m。也就是說主要是溶質與水溶液可以形成親水聚合物，在于另一種親水性聚合物相混合時，就可自然分離成兩水相體系，如表1 所示。這也就導致了雙水相體系常溫操作簡便、條件溫和的特點。

表1 幾種常見的雙水相聚合物體系

2 雙水相萃取技術在生物制藥中的應用

基于雙水相萃取技術的使用優勢，在生物制藥方面，尤其是在蛋白質、酶、細胞膜、核酸以及天然組分等分離提純方面，該項萃取技術都有著廣泛的應用。

2.1 雙水相萃取技術在提純分離蛋白質中的應用

該項萃取技術最早的應用手段就是用于蛋白質、酶組分的純化，在上世紀60 年代的研究中，人們就發現利用雙水相系統分離生物大分子，可以得出蛋白質、酶、核酸、抗原抗體以及細胞的分配數據。由于傳統萃取技術分離出的蛋白質、酶都會變性失活，雙水相萃取技術在生物應用之初就表現出極大的優勢。

例如利用PEG4000/磷酸鹽萃取液從細胞破碎液中分離青霉素酰化酶，萃取率可以達到90%以上，純度也很高，將該方案進行工業化制取青霉素酸化酶應用將帶來極大便利；利用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系從發酵液中萃取α 蛋白酶、淀粉酶等，萃取回收率可達60%，活性比原發酵液高出1.5 倍，效果顯著；利用雙水相萃取技術常溫從枯草芽孢桿菌發酵液中分離β-甘露聚糖酶，相比原發酵液純度可達2.76 倍，同時萃取回收率也接近99%。

同樣利用雙水相萃取技術分離提純蛋白質過程中，通過研究牛血清蛋白在聚乙二醇或硫酸鹽形成的兩水相水溶液中的分層特點發現，牛血清蛋白主要形成在雙水相體系的下層，同時通過改變硫酸鹽含量即雙水相體系的酸堿度，并不會對兩水相溶液的分配比產生影響；然而在雙水相體系中添加氯化鈉卻會顯著改變牛血清蛋白在體系中的分配情況，在雙水相體系中未添加氯化鈉離子時，牛血清蛋白主要形成在雙水相體系中的下層，而隨著氯化鈉離子的加入，牛血清蛋白在雙水相體系中會占據上層、甚至存在于雙水相體系的上表層。

2.2 雙水相萃取技術在分離抗生素中的應用

在20 世紀90 年代人們利用雙水相系統分離生物小分子時，包括抗生素、氨基酸以及天然藥物提純過程中，發現雙水相萃取技術在能耗上要明顯低于傳統萃取技術，同時在提取效率上也有著顯著優勢。例如利用PEG3350/K2HPO4溶液萃取青霉素G 發酵液，青霉素G 的分配系數可達13～14.5，萃取率高達97%，提純純青霉素溶液時，萃取率也能達到95%；在利用雙水相萃取技術分離提純抗生素時，影響抗生素提純分離的因素主要是疏水作用力，例如在現階段研究中發現了紅霉素純品、乙酰螺旋霉素純品在雙水相系統中的萃取分配行為，可以清除的看出聚合物平均分子量、pH 值等因素對提純物分配系數的影響。

同理，利用雙水相萃取技術從發酵液中分離提取丙酰螺旋霉素，雙水相體系可選用PEG 以及磷酸氫鈉溶液，萃取酸堿度及磷酸氫鈉含量通常控制在pH=8.5 左右，PEG 水相質量分數14%，磷酸氫鈉溶液含量18%，通常丙酰螺旋霉素的提純效率可達69.2%。利用該體系完成丙酰螺旋霉素的提純作用，提純效率主要受PEG 相對分子量的影響，通常選用相對分子質量較小的PEG 可以減緩高聚物分子的相互排斥，通過降低水相體系之間的黏度，促進丙酰螺旋霉素的分離提純效果，從而提高抗生素分離效率。

2.3 雙水相萃取技術在提純天然組分中的應用

天然組分在生物制藥中的應用占據很大比重，利用雙水相萃取技術分離提純天然產物組分，可以有效保護所需組分的活性。例如研究葛根素在PEG/（NH4）2SO4雙水相體系以及丙酮/K2HPO4溶液中的分離特征，在前者體系中PEG1500 質量分數達到20%，（NH4）2SO4質量分數達到16%，所得組分的分配系數高達148.2，同時萃取回收率高達99%以上；而在后者丙酮萃取溶液中，丙酮與水的質量配比為8∶2，K2HPO4質量1.5 g，最終所得萃取回收率達到了99.55%，因此可以看出雙水相萃取技術在提純天然組分中的應用效果較好[1]。

2.4 其他雙水相萃取體系的應用

1）電泳分離氨基酸小分子。隨著雙水相萃取技術的普及應用，研究人員進行了利用雙水相技術電泳分離氨基酸小分子方面的研究，通過分析雙水相及自由流動電泳對核內體的分離現象，發現僅需配置自由流動性電泳，就可實現核內體的溶解分離，無需僅需兩相分離實現小分子氨基酸的提純效果。在現階段的應用中，實現了聚乙二醇、葡聚糖、氨基酸小分子的電泳分離研究，通過分析水相濃度、萃取效率以及總傳質量，得出了利用雙水相技術電泳分離氨基酸的一些規律。

2）雙水相技術表面活性劑方面的應用。通過利用季銨鹽型陽離子表面活性劑以及陰離子表面活性劑兩種體系按一定濃度混合，形成一種新型雙水相體系，由于季銨鹽型陽離子的頭基比較大，可以形成一種分離檢測溶液，實現一些低濃度、痕量成分的檢測效果，該檢測溶液具有操作簡單、檢測速率快等特點。同時由于該新型雙水相溶液僅含低濃度的表面活性劑，因此不會造成生物活性物質的變形失活，可以廣泛應用于該方面的分離提純過程。

3 雙水相萃取技術的研究

分離提純技術的高低直接影響到生物制藥工業化發展進程，數據表明生物制品的接近90%都依賴萃取分離過程，因此研發效率更高，技術可靠的分離提純技術是保障生物制藥工業化高效快速發展的前提條件。

3.1 新型雙水相萃取體系的研發

雙水相萃取體系在生物制藥中的應用包括聚合物/聚合物/水、聚合物/無機鹽/水兩種，前一種體系使用成本較高，不利于工業化生產應用；后者則由于無機鹽廢棄液的存在，不進行廢水處理會對生態環境造成嚴重破壞，也影響到工業化生產應用。也就是說，新型雙水相萃取體系的未來研發方向，主要集中在廉價型雙水相體系的研發工作中，通過應用一些成本低廉的高聚物，來代替現有成本高昂的高聚物。例如利用羥基纖維素代替PEG，或利用乙烯基氧與丙烯基氧相混合形成的聚合物，與PEG 組成的溫敏性雙水相溶液，通過低成本高聚物或對高聚物進行有效低成本回收，降低雙水相萃取技術的工業化應用成本。因此研發綠色清潔的雙水相萃取體系，也是確保該項萃取技術邁向工業化生產階段的前提保障。

現階段的研究發現，利用廉價的變性淀粉、糊精、麥芽糖等產品替代葡萄糖，利用廉價的聚乙烯醇、羥基纖維素等替代PEG，所得的雙水相體系進行生物制藥的工業化萃取，成本相對較低，有著工業化應用前景；同時利用離子液體雙水相體系，與傳統雙水相體系萃取相比，利用離子液體、雙水相萃取系統相結合的方式，萃取粘度更低、分離提純時間更短，同時離子液體可以回收再利用，也是未來雙水相萃取技術的發展方向[2]。

3.2 雙水相萃取技術的集成化與耦合

該項萃取技術雖然在生物分離萃取領域應用廣泛，但仍然存在著一些問題，包括萃取過程中的乳化現象、分離提純耗時長、成相聚合物成本昂貴等問題，也是限制該萃取技術工業化應用的顯著缺陷。因此，通過將該項技術與其它技術進行集成耦合，就可充分發揮出集成系統的各項優勢，對萃取技術存在的缺陷進行彌補，集成系統的優勢包括：

1）萃取技術與磁場、超聲波以及氣溶膠技術集成耦合，可以有效提高萃取分離速率，同時也可避免有機溶質的乳化問題，有助于萃取技術的工業化生產應用；

2）萃取技術與親和沉淀、層析等生化分離技術集成耦合，可以使萃取分離技術更為簡潔高效。通過與生物轉化、化學滲透以及電泳等技術集成，可以有效解決萃取技術無法工業化批量生產難題，為細胞、酶的回收利用提供借鑒。

3.3 成相聚合物循環利用

基于成相聚合物成本昂貴的問題，在工業化應用方面確保成相聚合物的循環使用，是降低生產成本，批量化規模化發展雙水相萃取技術的關鍵。在現階段的研究中發現，在成相聚合物PEG 中加鹽生產新的萃取體系，可以使酶向富鹽相偏移，從而實現聚合物循環利用目的[3]。例如通過上述氯化鈉溶液在牛血清蛋白中的配比，將原有牛血清蛋白從雙水相體系中的下層，隨著氯化鈉含量的提高遷移至雙水相體系中的上層甚至雙水相體系中上表層，實現相偏移效果；同時通過超濾技術，選用適當的超濾膜，可以將PEG 小分子過濾出來而阻隔蛋白子大分子通過，實現PEG組分的循環利用；還可以通過吸附、電泳以及離子交換等手段，利用蛋白子與PEG 電性質的差異，實現成相聚合物的循環利用。包括利用離子含量即相對分子質量降低高聚物排斥性，通過減緩雙水相體系濃度提高抗生素分離效率方面的應用。通過雙水相技術研究電泳過程中核內體中分離氨基酸的效果等；最后，通過親和分配與雙水相萃取技術結合使用，也可以有效節省PEG 的用量。通過利用表面活性劑組成的雙水相萃取體系，用于成分分離檢測，基于表面活性劑含量較少不會影響到生物活性物質活性，從而高效應用于生物活性物質的分離提純過程。

4 結語

雙水相萃取技術現已被廣泛應用于基因工程、蛋白質工程等高新生物技術當中，但這些高新生物技術對生化分離技術的要求也更為苛刻，尤其是操作步驟更為繁瑣、處理時間也更長，嚴重影響該項技術的工業化發展進程。分析雙水相萃取技術的特征，就其溫和高效的分離提純過程，以及提純過程不會使物質失活破壞的特點，通過不斷完善該項技術的集成工藝，研發效率更高、技術可靠的雙水相萃取技術，同時不斷探索成本低廉的高聚物代替品，加快雙水相萃取技術的工業化應用，是保障雙水相萃取技術實現生物制藥工業化，并高效快速發展的前提條件。