雌穗膨大多行數(shù)玉米突變遺傳性狀鑒定評價

楊 萌, 文仁來, 田樹云, 黃愛花, 鄒成林, 莫潤秀,翟瑞寧, 黃開健, 韋新興, 譚業(yè)琴, 何雪銀

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所, 南寧 530007;2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué), 南寧 530007)

雌穗是玉米產(chǎn)量的直接載體,穗長、穗粗、穗重、穗行數(shù)、行粒數(shù)和軸粗、軸重等是重要的產(chǎn)量組成部分[1]。在相同種植密度下,玉米單位面積產(chǎn)量由雌穗數(shù)和單穗籽粒產(chǎn)量決定,而單穗籽粒產(chǎn)量由每穗粒數(shù)和百粒重決定,每穗粒數(shù)由穗行數(shù)和行粒數(shù)決定[2]。通常情況下雌穗體積越大,籽粒行數(shù)越多,單株產(chǎn)量越大。但熱帶、亞熱帶玉米材料相較于溫帶玉米材料雌穗偏小、穗行數(shù)偏少,因此鑒定、分析從廣西亞熱帶玉米群體改良過程中收集的雌穗膨大多行數(shù)玉米材料的表型遺傳特性,對進(jìn)一步解析玉米雌穗行數(shù)的內(nèi)在決定因素及其遺傳規(guī)律,定向改良廣西玉米育種群體的穗行數(shù)性狀具有重要意義。

玉米生殖生長開始后,莖頂端分生組織轉(zhuǎn)變成花序分生組織(Inflorescence meristem,IM),IM形成排列整齊的成對小穗分生組織(Spikelet pair meristem,SPM),1個SPM產(chǎn)生2個小穗分生組織(Spikelet meristem,SM),每個SM再產(chǎn)生2個小花分生組織(Flower meristem,FM)[3],共經(jīng)歷生長錐伸長、小穗分化、小花分化和性器官形成4個時期成為雌穗[4]。整個過程由多個基因共同調(diào)控,主效基因較少,微效QTL較多[5-6],包括直接調(diào)控花序分生組織生長發(fā)育的基因[7-12]和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[13-16]、植物激素[17-19]及micro RNA[20-21]等調(diào)節(jié)因子。其中,雌穗行數(shù)(即在垂直穗軸方向上由SPM最終發(fā)育成的FM數(shù)目)是玉米產(chǎn)量高低的決定因素之一[22-23]。復(fù)合區(qū)間作圖和玉米SNP10/50芯片等技術(shù)是挖掘基因位點(diǎn)的常用方法,多年來研究人員利用該方法在不同染色體上鑒定出多個穗行數(shù)相關(guān)QTL[24-26]。同時利用多份不同的自然群體材料進(jìn)行表型-基因型關(guān)聯(lián)分析,也是挖掘穗行數(shù)相關(guān)位點(diǎn)的有效方法。Liu等[27]在5個種植環(huán)境下對513份自然群體的玉米材料的雌穗性狀進(jìn)行最佳線性無偏預(yù)測分析(Best linear unbiased prediction,BLUP),在10條染色體上檢測到17個穗行數(shù)QTL,其中24個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)變異可解釋大于5%的表型變異。Xiao等[1]利用包含14個親本遺傳背景的10個重組自交系(Recombined inbred lines,RIL)復(fù)合群體,獲得控制4個穗部性狀的107個QTL,其中控制穗行數(shù)的QTL多為加性或部分顯性效應(yīng)。Chen等[28]利用序列基因分型(Genotyping by sequence,GBS)測序分析方法繪制高密度染色體圖譜得到一個重要穗行數(shù)位點(diǎn)qKRN5,但基因的定位區(qū)間長達(dá)4.8 Mb,其他多個穗部性狀QTL最小定位區(qū)間也大于700 K。因此,精細(xì)定位并克隆更多穗行數(shù)相關(guān)QTL進(jìn)行玉米雌穗性狀的分子改良仍然任重道遠(yuǎn)。在調(diào)控雌穗軸發(fā)育的單基因突變中,研究較為深入的是FEA2基因,該基因編碼一個受體蛋白,通過CLAVATA基因信號通路調(diào)節(jié)分生組織發(fā)育,其突變體雌穗分生組織過度增殖導(dǎo)致雌穗過度膨大[29]。Peter等[10]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),一份FEA2基因的弱等位突變型,在引起穗軸扁化和穗行數(shù)增加的同時不導(dǎo)致果穗過度變形,比野生型植株增產(chǎn)13%。Byoung等[30]報道了與FEA2表型相似的突變體FEA3,其雌穗頂端出現(xiàn)多個生長點(diǎn),穗軸扁化,研究表明,FEA3通過響應(yīng)CLAVATA3/CLE在器官原基中的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控雌穗分生組織增殖,其弱等位突變型同樣能提高雜交玉米產(chǎn)量。

本研究對廣西亞熱帶玉米群體進(jìn)行改良的過程中收集到一份雌穗膨大多行數(shù)材料,但對于該材料的種質(zhì)背景、變異特征、細(xì)胞組織特征以及受單一基因還是多個QTL位點(diǎn)調(diào)控等方面并不清楚,難以開發(fā)利用,因此將其與穗軸較細(xì)、穗行數(shù)12行的優(yōu)良育種材料桂18421雜交再自交構(gòu)建遺傳分析群體,進(jìn)行性狀鑒定和遺傳背景分析,以明確該材料表型性狀的遺傳分離規(guī)律,并利用40對SSR標(biāo)記和23份廣西育種中使用的骨干自交系,對該多行數(shù)玉米材料自交過程中保留的2個姐妹系進(jìn)行遺傳背景分析,為利用多行玉米材料進(jìn)行玉米群體改良、新品種選育、QTL挖掘及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)材料為廣西基礎(chǔ)育種群體(7239與CML285雜交建立的選系群體,7239為早年間玉米品種隆玉2號的母本之一,CML285來自國際玉米小麥改良中心,該群體曾選育出廣西優(yōu)良雜交品種桂單0810的母本桂39722)和對新材料培育中發(fā)現(xiàn)的雌穗膨大變異植株(經(jīng)多代自交純化形成的穩(wěn)定變異材料),該變異株穗行數(shù)22行,初步命名為fcb(flat corncob),在自交純化過程中保留了2個姐妹系,分別命名為fcb1和fcb2(圖1B、C),其雌穗外形與已報道的FEA2基因弱等位型突變體具有一定相似性(圖1D～G)[10]。試驗(yàn)對照材料為穗行數(shù)12行的廣西自選材料桂18421(圖1A)。

注:A為對照桂18421,B～C為fcb,D～G為FEA2突變體及等位突變表型。

1.2 方 法

1.2.1 田間種植

將fcb1(P1)與桂18421(P2)雜交,并連續(xù)自交2代,構(gòu)建F2∶3群體,進(jìn)行農(nóng)藝表型、細(xì)胞形態(tài)和遺傳分離分析,P1、P2、F1、F2和F3各世代分別調(diào)查10株、10株、10株、300株和3 000株,田間種植管理與大田農(nóng)業(yè)生產(chǎn)相同。與fcb兩個姐妹系(fcb1和fcb2)以及其他23份材料一起進(jìn)行遺傳背景分析(表1)。

表1 用于遺傳背景分析的玉米材料名稱及其來源

1.2.2農(nóng)藝性狀測定與分析

進(jìn)行表型測量的P1、P2、F1和F2各代植株全部自交授粉,待果穗收獲曬干后考察穗粗、軸粗、穗行數(shù)以及穗軸是否扁化,穗粗和軸粗分別用游標(biāo)卡尺測量橫切面,扁穗橫切面表現(xiàn)出橢圓形,分別測量其(穗、軸)長、短直徑,并以平均值表示該果穗的穗粗或軸粗,以長軸/短軸表示穗或軸的扁化程度,比值等于1表示未發(fā)生扁化。P1、P2和F1的各項(xiàng)表型數(shù)據(jù)分別為10株的平均值,F2∶3家系的穗行數(shù)測定為F2單株結(jié)合相應(yīng)F3后代數(shù)據(jù),其300份F2雌穗分別單穗考種,300行F3每行測定10枚雌穗取平均值與對應(yīng)上代F2進(jìn)行比較,以增加F2表型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.2.3細(xì)胞組織觀察

在授粉后5～10 d,取發(fā)育中的幼嫩雌穗,在雌穗中上部垂直穗軸方向橫切取樣,制作石蠟切片和番紅固綠染色,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)形態(tài),主要步驟如下:

材料脫水:將新鮮雌穗組織用FAA固定液固定24 h,然后取出放于脫水盒內(nèi),再放進(jìn)脫水機(jī)內(nèi)依次用不同濃度梯度乙醇進(jìn)行脫水:75%乙醇4 h,85%乙醇2 h,90%乙醇2 h,95%乙醇、1 h,無水乙醇2次,各30 min,醇苯1次10 min,二甲苯2次,各10 min。

石蠟包埋:65 ℃融化石蠟1 h,將浸好蠟的細(xì)胞組織置于包埋機(jī)內(nèi)并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽,再置于-20 ℃凍臺冷卻,蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

切片:將修整好的石蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片(厚4 μm),切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上將組織展平,載玻片將組織撈起,60 ℃烘箱內(nèi)烤片。

脫蠟:依次將切片放入二甲苯脫蠟2次,各20 min,無水乙醇脫蠟2次,各5 min,75%乙醇1次5 min,蒸餾水清洗。

染色:將切片放入植物番紅染色液中染色2 h,自來水清洗去除多余染料,將切片依次放入50%,70%和80%梯度乙醇中各5 s,之后將切片放入植物固綠染色液中染色約15 s,無水乙醇脫水3次。

封片觀察:將切片置于二甲苯中透明5 min,中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,進(jìn)行圖像采集。

1.2.4遺傳背景分析

采用CTAB小量提取法制備玉米基因組總DNA[31],從玉米基因組數(shù)據(jù)庫(www.maizegdb.org)中查找合成SSR標(biāo)記,選擇其中帶型清晰、分布均勻,多態(tài)性明顯的40對(表2),采用10 μL PCR體系擴(kuò)增,經(jīng)7%聚丙烯酰胺凝膠電泳,0.1%硝酸銀染色顯影,以Excel2016軟件記錄帶型統(tǒng)計(jì)結(jié)果,將相同遷移率位置上有條帶的記1,無條帶的記0。

表2 40對SSR標(biāo)記

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2016軟件記錄測量數(shù)據(jù),利用SPASS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;采用NTsys2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多穗行玉米雌穗表型性狀分析

雌穗膨大主要表現(xiàn)為穗行數(shù)增加、果穗變粗、穗軸變粗、穗扁化和軸扁化5種特征,這些特征在F2代發(fā)生不同程度的分離。如圖2所示,在F2代分離群體中,F2代穗行數(shù)具有12,14,16,18,20,22行共6種分離表型,相關(guān)性分析結(jié)果(表3)顯示,雌穗行數(shù)與穗粗、軸粗及穗扁化度均呈極顯著性相關(guān),與軸扁化度不相關(guān),說明該變異材料雌穗膨大性狀的不同特征可能受多個數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)分別控制,且不同位點(diǎn)之間有累加或協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果(表4)表明,不同雌穗行數(shù)對穗粗有極顯著性影響,對軸粗存在顯著性影響,同時由穗粗、軸粗與行數(shù)的相關(guān)性度量分析結(jié)果(表5)可知,隨著雌穗行數(shù)的增多,穗粗增加的正向效應(yīng)大于軸粗,說明其QTL增加穗行數(shù)帶來的增產(chǎn)潛力大于其負(fù)面影響。在F2分離群體中,6種穗行數(shù)的玉米分離比為1∶9.6∶12.6∶7.9∶1.8∶0.6,呈連續(xù)正態(tài)分布,說明有2個QTL調(diào)控影響穗行數(shù)性狀,基因間具有累加效應(yīng)。

圖2 F2群體不同穗行數(shù)頻率分布情況

表3 F2群體各表型性狀指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果

表4 F2群體不同行數(shù)對穗粗與軸粗的影響

表5 F2群體穗粗、軸粗與行數(shù)的相關(guān)度量分析結(jié)果

2.2 多穗行玉米雌穗膨大的細(xì)胞學(xué)成因

通過對幼嫩雌穗做橫截面石蠟切片,經(jīng)番紅固綠染色后進(jìn)行光學(xué)顯微觀察,發(fā)現(xiàn)穗軸變異特征表現(xiàn)出分生組織體積變大,髓腔及其外圍維管束數(shù)目和層數(shù)變多,在正常維管束層外圍和小穗著生部位出現(xiàn)較多散亂分布的形態(tài)完整度不一的維管組織細(xì)胞,如圖3所示,該特征與FEA2弱等位突變型植株的雌穗表型變化較類似[15],主要為花序分生組織細(xì)胞過度分裂分化,穗軸各心皮在生長過程中過度發(fā)育相互擠壓,導(dǎo)致穗軸變形。

圖3 fcb雌穗橫切面小花形態(tài)

2.3 多穗行玉米的雜種優(yōu)勢群劃分

利用40對SSR標(biāo)記在25份樣品中共檢測出162個電泳帶型清晰穩(wěn)定、多態(tài)性良好的等位基因,每對標(biāo)記可檢測3～5個,平均4.1個。以遺傳相似度系數(shù)0.77為標(biāo)準(zhǔn),可將25份玉米材料劃分為3個雜種優(yōu)勢群,少量遺傳距離較遠(yuǎn)的種質(zhì)材料無法有效分群。

第Ⅰ類群包含6份材料,是以泰國Swan(late)C4群體為基礎(chǔ)選育的熱帶、亞熱帶玉米材料及其衍生種質(zhì),包含品種桂單0810的父本桂兆18421。第Ⅱ類群包含10份材料,以遺傳相似度系數(shù)0.79為標(biāo)準(zhǔn),可進(jìn)一步分為2個亞群,第Ⅱ-1亞群以桂39722為核心,包含掖478,具有一定亞熱帶種質(zhì)血緣的改良瑞德群體;第Ⅱ-2亞群包括4份廣西本土自交系材料。第Ⅲ類群包含3份材料,均為廣西本土自交系。此外有3份種質(zhì)材料(先21A、LH196、W8555)與其他材料遺傳距離較遠(yuǎn),未能有效分群。本研究中使用的玉米材料齊319、丹340和黃早4為國內(nèi)玉米雜種優(yōu)勢群常用測驗(yàn)種,聚類分析結(jié)果表明,本研究未包含與其背景較為相近的種質(zhì)材料。由此可知,fcb與目前廣西本土主栽的桂單0810、母本桂39722、廣西國審品種桂單203、母本桂F0857、玉米新組合689、父本GML2020及掖478等劃歸為一類,屬于具有溫-熱種質(zhì)背景的改良瑞德群體,而其自交過程中保留的兩個姐妹系在40對SSR標(biāo)記中未檢測到差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 玉米雌穗膨大材料為一份新的基因變異

在已公開報道的參與調(diào)控雌穗發(fā)育的相關(guān)基因中,2013年報道的玉米基因FEA2發(fā)生隱性突變后可導(dǎo)致雌穗的膨大變形,最終引起穗行數(shù)增加而促進(jìn)增產(chǎn)[29],本研究材料與2016年報道的FEA2弱等位突變表型較相似,但又具有明顯不同的特點(diǎn):FEA2基因調(diào)控雌穗分生組織發(fā)育,基因突變后表型變化比較劇烈的等位型會出現(xiàn)分叉和不規(guī)則的雌穗,弱等位突變型會導(dǎo)致雌穗扁化、穗軸變粗、尖端月牙形、穗行數(shù)增加和穗行不整齊、穗中部籽粒不飽滿等表型,且這些變化在后代不會發(fā)生分離[10]。本研究材料具有的此類特征會在F2代等后代群體不同單株間發(fā)生一定分離,表明其雌穗體積增大、變化及多行數(shù)等特征可能由多個QTL控制,這點(diǎn)與FEA2基因的突變體不同。2022年報道的控制玉米穗行數(shù)的KRN2基因來自具有野生玉米背景穗行數(shù)6行的特異玉米材料,其野生等位型負(fù)調(diào)控玉米雌穗行數(shù),利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的KRN2基因功能喪失材料可提高約10%的玉米產(chǎn)量[32]。可知,已克隆的FEA2和KRN2基因介導(dǎo)的性狀變化與本研究材料fcb明顯不同,因此fcb可能為新的未知基因位點(diǎn)變異,后期進(jìn)一步將fcb增加穗行數(shù)的基因位點(diǎn)單獨(dú)分離進(jìn)行精細(xì)定位和基因克隆,具有較高的基礎(chǔ)理論研究和育種應(yīng)用價值。

3.2 雌穗行數(shù)與玉米產(chǎn)量密切相關(guān)

本研究根據(jù)廣西種子管理局網(wǎng)站(http://www.gxseed.com.cn)公布的信息,對2005年、2014—2021年年度所有玉米品種的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸納統(tǒng)計(jì),顯示最近十多年間審定廣西玉米品種的穗行數(shù)平均增幅約7%,穗粗平均增幅約6%,千粒重平均增幅約10%,而穗長降幅約5%,行粒數(shù)降幅約9.5%,穗粒重和單位株數(shù)基本保持不變,表明玉米籽粒的容重和穗行數(shù)是近年來廣西玉米品種的重要增產(chǎn)點(diǎn),與鄒成林等[33]和梁曉玲等[34]的研究結(jié)果一致。一般情況下,穗行數(shù)增加易伴隨穗軸變粗和籽粒變小、千粒重降低等不利性狀,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,廣西玉米品種的選育在提升穗行數(shù)的同時較好地將穗粗增幅控制在較低水平,同時提高了千粒重,而行粒數(shù)略微降低源自籽粒厚度增加,實(shí)際有助于增加籽粒品質(zhì)和千粒重。

3.3 調(diào)控穗行數(shù)的QTL的開發(fā)利用

本研究中,利用40對SSR標(biāo)記進(jìn)行的遺傳背景分析,將fcb劃歸為屬于具有溫-熱混合血緣背景的改良瑞德群體。因此,一方面可以通過常規(guī)雜交育種的方式,利用fcb對同雜種優(yōu)勢群的優(yōu)良材料及衍生品系進(jìn)行穗行數(shù)性狀改良,或者與其他雜種優(yōu)勢群的材料進(jìn)行雜交組配,選育新品種[35-36];另一方面,利用分子生物學(xué)技術(shù)挖掘其與穗行數(shù)相關(guān)的基因位點(diǎn),通過分子標(biāo)記輔助進(jìn)行單基因?qū)?實(shí)現(xiàn)對穗行數(shù)的定向改良,可以克服雜種優(yōu)勢群的限制。此外,可以進(jìn)一步將fcb與其他控制雌穗發(fā)育的優(yōu)良基因,例如玉米基因ZmKL9(能顯著提高玉米粒重、穗長和穗粒數(shù)[37])、ZmEXPB15基因(調(diào)控玉米籽粒大小和粒重[38])等進(jìn)行基因聚合,以更有效地在增加穗行數(shù)的同時避免穗軸變粗、容重降低、籽粒變小、千粒重減小、雌穗變短以及配合力降低等負(fù)面影響[39]。因此,在后續(xù)研究中,可利用篩選出的行數(shù)多和行數(shù)少的F2∶3家系,分別提取F2葉片DNA,構(gòu)建兩個極端DNA混池,在全基因組利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因初步定位,并利用高世代回交群體進(jìn)一步精細(xì)定位,開發(fā)與穗行數(shù)相連鎖的分子標(biāo)記。

綜上所述,從廣西玉米基礎(chǔ)群體中收集的雌穗膨大多行數(shù)玉米材料為一份新的未知基因突變材料,具有溫-熱混合血緣背景,其多穗行性狀符合廣西玉米生產(chǎn)需求,可用于群體性狀改良或利用溫-熱×熱雜種優(yōu)勢配對模式對其進(jìn)行雜交組配,選育新品種。同時,可進(jìn)一步挖掘其控制穗行數(shù)的QTL,進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種及解析玉米雌穗發(fā)育的分子遺傳機(jī)理。